湯 曦 吳 青 鄭春霞 張明超 曾彩虹 張 炯 朱曉東 劉志紅

局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)是成人腎病綜合征的常見病因之一。FSGS的病變突出表現(xiàn)在足細(xì)胞損傷,但其病因復(fù)雜,除免疫因素外,還有毒物、代謝、血流動力學(xué)、感染、遺傳等多種因素參與[1]。FSGS的形態(tài)學(xué)特點為局灶、節(jié)段性病變,但是腎小球局部病變性質(zhì)不均一,對治療的反應(yīng)和預(yù)后也不相同。雖然糖皮質(zhì)激素是目前治療 FSGS的首選藥物,但成人 FSGS激素治療反應(yīng)較差,完全緩解率不足 30%[2]。臨床上觀察到鈣神經(jīng)蛋白抑制劑(calcineurin inhibitor,CNI)治療激素依賴、抵抗的腎病綜合征緩解率達(dá)80%[3,4]。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為 CNI通過抑制活化 T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)信號通路、調(diào)節(jié) T細(xì)胞免疫治療腎臟疾病。近期有研究發(fā)現(xiàn) CNI可直接抑制由足細(xì)胞calcineurin(Cn)過度活化介導(dǎo)的 synaptopodin去磷酸化,穩(wěn)定細(xì)胞骨架,促進(jìn)足細(xì)胞的修復(fù)[5]。上述研究表明,足細(xì)胞Cn的過度活化將觸發(fā)足細(xì)胞損傷過程,而有效地抑制其活性可逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞病變。Cn由催化亞基 A(CnA)和調(diào)節(jié)亞基 B(CnB)組成,其主要活性單位為 CnA亞基。CnA又分為 α、β、γ三種亞型,不同組織中 CnA亞型分布不同。那么,FSGS患者足細(xì)胞是否表達(dá) Cn,若有,它是否與疾病活動有關(guān),能否有助于 FSGS的臨床診斷和治療選擇。為此,本研究對 FSGS患者腎組織 Cn的表達(dá)進(jìn)行了觀察。

對象和方法

病例選擇 納入年齡≥16歲,尿蛋白＞3.5g/24h,血清白蛋白 ＜35 g/L,血清肌酐＜265.3μmol/L,且經(jīng)腎活檢明確診斷的患者,排除肥胖、糖尿病腎病、乙肝、淀粉樣變性等繼發(fā)因素,選取特發(fā)性 FSGS 63例(平均年齡 24.5歲,男 /女為47/16),MCD 24例 (平均年齡 27.6歲,男/女為17/7),及腎移植供腎 10例。活檢時 FSGS患者尿蛋白(8.76±4.62)g/24h,尿視黃醇結(jié)合蛋白(rentiol binding protein,RBP)2.16(0.01～210.7)mg/L,血清肌酐(106.08±55.69)μmol/L均高于MCD患者(P＜0.05);二者間年齡、性別、尿 N-乙酰-β-葡萄糖苷酶 (N-Acetyl-β-D-Glucosaminidase,NAG)、血清白蛋白以及血清總膽固醇等均無統(tǒng)計學(xué)差異(表1)。

表1 腎活檢時患者的臨床特征

腎活檢組織病理 腎組織石蠟切片行 HE、PAS、PASM、Masson三色染色,光鏡下觀察腎組織病變,根據(jù)哥倫比亞方法[6]對 FSGS病變進(jìn)行分型;免疫病理采用冰凍切片直接免疫熒光法;電鏡組織以3.75%冷戊二醛固定,1%四氧化鋨后固定,60～70 nm超薄切片,醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色,置于Hitachi 7500透射電子顯微鏡下觀察。

腎組織 CnA免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片(2μm)脫蠟,在甲醇中用 3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶 30 min。10mM的檸檬酸鹽緩沖劑(pH6.0)條件下加熱 30 min修復(fù)抗原,置PBS-0.1%小牛血清 15 min后,再加入 10%小牛血清封閉。分別加兔抗人CnAα、β、γ一抗(Santa CruZ,MA,1∶50)、Cn A+B抗體(Chemicon,CA,1∶100),4℃孵育過夜,PBS洗三遍,然后加二抗EnVision(Dako,CA)孵育 30 min。用DBA顯色,蘇木素復(fù)染核,中性樹膠(Sigma,USA)封片,置顯微鏡(Olympus BX51,Tokyo,Japan)下觀察。選取人扁桃體組織,采用上述染色作為陽性對照,用同等濃度的非免疫兔血清 IgG(Dako,CA)染色作為陰性對照。

腎組織 synaptopodin免疫熒光染色 石蠟切片按上述方法脫蠟、修復(fù)抗原后,加入羊抗人synaptopodin一抗(SantaCruz,MA,1∶10),避光 ,濕盒內(nèi)室溫孵育 2h,PBS漂洗三次;然后加入硫氰酸四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine isothiocyanate,TRITC)標(biāo)記的驢抗羊二抗(Dako,CA,1∶50),濕盒內(nèi)室溫孵育 40 min,PBS漂洗三遍,吹干,采用抗淬滅的封片劑(Vector Laboratories,CA)封片,置熒光顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)同等曝光條件下觀察。

結(jié)果判斷兩位病理醫(yī)生分別盲法評判染色結(jié)果。選取≥10個腎小球的組織標(biāo)本進(jìn)行分析。非節(jié)段病變的單個腎小球中≥50%足細(xì)胞 CnAα陽性定義為腎小球 CnAα陽性?；颊吣I組織中≥1個腎小球陽性即為 CnAα陽性病例。單個切片上選取熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的 5個腎小球進(jìn)行 Syanaptopodin染色評分。染色強(qiáng)度分為:++,+,-[7]。

腎組織CnAα與 synaptopodin雙重免疫熒光染色石蠟切片如前步驟脫蠟、修復(fù)抗原后,加入Avidin/biotin非特異性結(jié)合 15 min,0.1%馬血清封閉10 min,加兔抗人 CnAα一抗(1∶50)孵育 2h,加生物素化抗兔 IgG二抗(Vector Laboratories,CA,1∶200)孵育 30 min,PBS漂洗三次,再加熒光素標(biāo)記 Avidin DCS(Vector Laboratories,CA,1∶300)孵育 10 min。非特異性交叉反應(yīng)采用 Avidin/biotin封閉 15 min,0.1%馬血清封閉 10 min,加羊抗人 synaptopodin(1∶20)孵育 2h,加生物素化抗羊 IgG(Vector Laboratories,CA,1∶400)孵育 30 min,再加稀釋的德克薩斯紅 Avidin DCS(Vector Laboratories,CA,1∶400)孵育10 min,PBS洗三次,甘油封片,共聚焦熒光顯微鏡(LSM510,Carl Zeiss)下觀察并掃描采集圖像。

免疫電鏡 將腎組織塊切塊(1 mm3),放入含2%(w/v)甲醛和 0.02%(v/v)戊二醛 (p H7.2)的0.1M PBS固定劑(p H7.4)中,室溫固定 2h,PBS漂洗三次,投入含 10%明膠溶液中 15 min,再投入含2.3 mol/L蔗糖的 0.1MPBS緩沖液中室溫下滲透處理 2h。參照 Tokuyasu技術(shù)[7]使用 Leica EM FC6冷凍超薄切片機(jī)進(jìn)行冷凍切片(90 nm),將其轉(zhuǎn)移至鎳網(wǎng)上。切片復(fù)溫后緩沖液漂洗,5%BSA孵育15 min,加入兔抗人 CnAα一抗(1∶50),4℃冰箱孵育過夜,漂洗,加入的羊抗兔二抗膠體金抗體(Aurion,PA,1∶25)室溫孵育 1h,PBS漂洗三次,1%戊二醛固定10 min,充分沖洗,再加由 2%(w/v)甲基纖維素溶液和 4%(w/v)酸性醋酸鈾溶液按9∶1比例配制的染液染色 5 min,切片干燥后置Hitach7500透射電鏡下觀察。

統(tǒng)計分析 采用 SPSS16.0 for windows統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料采用均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差或者中位數(shù)表示,組間采用 t檢驗或者非參數(shù)秩和檢驗;計數(shù)資料采用百分比描述,組間比較采用 χ2檢驗或者 Fisher確切概率法。采用 Kappa檢驗對兩位病理醫(yī)生的評判結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗。采用 logistic逐步回歸分析篩選與足細(xì)胞 CnAα過表達(dá)相關(guān)的因素。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

移植供腎組織 CN的表達(dá) 移植供腎組織腎小球 CnAα、CnAβ、CnAγ染色均陰性 (圖1 A1、2、3),近曲、遠(yuǎn)曲腎小管、皮質(zhì)集合管 CnAα、β微弱著色(圖2 D1、2,表2),腎小管 CnAγ染色陰性(圖2 D3)。

表2 CnA異構(gòu)體在供腎、微小病變(MCD)、局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)患者腎組織中的表達(dá)情況

FSGS與 MCD患者腎組織 Cn的表達(dá)分布 63例 FSGS患者腎小球 CnAβ、CnAγ均陰性(圖1 C2、3);其中 26例的腎小球 CnAα表達(dá)上調(diào)(圖1 C1),主要分布于毛細(xì)血管袢外緣(圖3 A、B)及部分包曼囊壁層上皮細(xì)胞(圖3 D)。腎小球節(jié)段硬化處 CnAα陰性(圖3 C)。 24例 MCD患者腎小球 CnAα、CnAβ、CnAγ表達(dá)均陰性(圖1 B1、2、3)。雙重免疫熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn) synaptopodin與 CnAα在同一部位表達(dá)(圖4),進(jìn)一步證實了 CnAα主要表達(dá)于腎小球足細(xì)胞。膠體金免疫電鏡顯示 CnAα顆粒主要分布于足突胞質(zhì)(圖5)。60例 FSGS和 7例 MCD腎小管 CnAα表達(dá)增加,彌漫分布達(dá)于近曲、遠(yuǎn)曲小管及集合管(圖2 E1、F1),近曲小管陽性程度強(qiáng)于遠(yuǎn)曲小管及集合管(表2)。腎小管 CnAα陽性患者伴同部位小管 CnAβ表達(dá)上調(diào)。局部近曲小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中 CnAα近基膜端聚集(圖2 F1),而 CnAβ在近曲小管上皮細(xì)胞頂膜刷狀緣側(cè)聚集(圖2 F2)。FSGS與 MCD患者腎小管 CnAγ均為陰性(圖2 E3、F3)。

圖3 局灶節(jié)段性腎小球硬化患者腎小球CnAα的表達(dá)分布

FSGS患者腎小球足細(xì)胞 CnAα與 synaptopodin的表達(dá) 26例(41.27%)FSGS患者足細(xì)胞 CnAα陽性,明顯高于 MCD患者 0%(P＜0.01)。其中 18例(69.23%)足細(xì)胞 CnAα陽性 FSGS患者的腎小球 synaptopodin表達(dá)減弱且不連續(xù)(圖6)。

FSGS患者腎小球足細(xì)胞 CnAα與臨床病理特點的關(guān)系 63例 FSGS患者活檢時的臨床病理特點見表3。足細(xì)胞 CnAα陽性的患者尿液 RBP 20.91(0.17,54.37)mg/L、血清肌酐(128.18±56.58)μmol/L高于陰性患者(P＜0.05);兩組間病理類型構(gòu)成存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01);而年齡、性別、蛋白尿程度、尿 NAG、血清白蛋白及膽固醇無統(tǒng)計學(xué)差異。比較不同病理類型 FSGS間足細(xì)胞 CnAα的陽性率,發(fā)現(xiàn)塌陷型(83.33%)＞細(xì)胞型(66.67%)＞頂部型(61.54%)＞門周型(20%),14例經(jīng)典型均陰性(P＜0.01,表3)。單因素 Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn) FSGS患者血清肌酐 (OR 4.229,P=0.01)、塌陷型(OR 43.333,P＜0.01)、細(xì)胞型 (OR 17.333,P＜0.01)、頂部型(OR 13.867,P＜0.01)與足細(xì)胞CnAα過表達(dá)相關(guān)。進(jìn)一步多因素 Logistic回歸分析示血清肌酐(OR 4.855,P＜0.01)、塌陷型(OR 11.069,P＜0.05)為 FSGS患者足細(xì)胞 CnAα過表達(dá)的主要相關(guān)因素(表4)。

圖5 膠體金免疫電鏡標(biāo)記 CnAα主要分布于局灶節(jié)段性腎小球硬化患者足突胞質(zhì)(箭頭示)

FSGS患者腎小球足細(xì)胞 CnAα與激素治療反應(yīng)的關(guān)系 63例 FSGS患者中 23例為初治或停用激素、雷公藤多苷等免疫抑制劑 2月以上的患者。10例(43.47%)初治患者足細(xì)胞 CnAα陽性,與非初治患者足細(xì)胞陽性率 47.83%相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。其中 12例初治 FSGS患者采用足量激素誘導(dǎo)治療,隨訪觀察 3月,發(fā)現(xiàn) 2例足細(xì)胞 CnAα陽性患者完全緩解;足細(xì)胞 CnAα陰性患者中 7例完全緩解,1例部分緩解,2例無效(P＞0.05)。

表3 足細(xì)胞 CnAα陽性與陰性FSGS患者的臨床病理特點比較

討 論

FSGS是表現(xiàn)為腎病綜合征的常見足細(xì)胞疾病,常伴腎小管間質(zhì)損傷,對激素反應(yīng)較 MCD差。部分早期 FSGS受腎活檢取材部位的影響,未見典型節(jié)段病變而不易與 MCD鑒別。對于激素抵抗的腎病綜合征患者,臨床 CNI降蛋白尿有效,但因具有腎毒性而受限制。就 CNI的腎毒性,既往研究關(guān)注 Cn在腎小管的作用[8];而其降蛋白尿的機(jī)制尚不完全明了。體外和動物實驗發(fā)現(xiàn) Cn的過度活化導(dǎo)致足細(xì)胞損傷、蛋白尿,但 FSGS患者腎小球內(nèi) Cn的表達(dá)、活性及作用目前尚無研究報道。

Cn是一種受 Ca2+及鈣調(diào)蛋白特異調(diào)節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶,廣泛分布于真核生物體內(nèi),通過去磷酸化離子通道、蛋白酶、受體、核轉(zhuǎn)錄因子如 NFAT,調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、流動、黏附等。生理情況下 Cn參與神經(jīng)元發(fā)生、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、軸突延伸、突觸發(fā)生、神經(jīng)介質(zhì)囊泡的胞吞和胞吐;激活 T淋巴細(xì)胞、釋放 IL-2等細(xì)胞因子并轉(zhuǎn)導(dǎo)信號等[9]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn) Cn的高表達(dá)在阿爾茨海默病[10]、腫瘤轉(zhuǎn)移[11]、心肌肥大[12]等疾病中起著重要作用。腎臟組織中主要表達(dá) CnAα、β,分布在近曲、遠(yuǎn)曲腎小管、髓袢升支粗段,而腎小球 Cn表達(dá)陰性[8]。其中 CnAα為腎臟發(fā)育所必需,特別對出生后腎臟的發(fā)育分化成熟至關(guān)重要[13]。糖尿病小鼠中腎小管、內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞 Cn表達(dá)上調(diào),參與了腎小球細(xì)胞肥大、胞外基質(zhì)增生[14]。體外實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子 β、胰島素樣生長因子 1通過Cn/NFAT信號通路介導(dǎo)系膜基質(zhì)肥大[15]。

表4 logistic回歸分析示與局灶節(jié)段性腎小球硬化患者足細(xì)胞CnAα表達(dá)上調(diào)相關(guān)的因素

本研究首次發(fā)現(xiàn) FSGS患者中非節(jié)段病變的腎小球足細(xì)胞 CnAα表達(dá)增加,而健康人和 MCD患者腎小球 Cn表達(dá)陰性。關(guān)于 MCD與 FSGS是一個疾病的不同階段,還是兩個不同的疾病,一直存在著爭議。臨床中觀察到首次腎活檢表現(xiàn)為 MCD的患者因蛋白尿控制不佳重復(fù)腎活檢為 FSGS[16]。人們試圖尋找某些生物標(biāo)記物鑒別兩者。Regele等[17]發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞骨架蛋白與腎小球基膜的連接分子肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖在 MCD患者中表達(dá)減弱,而 FSGS患者表達(dá)正常。Garin等[18]發(fā)現(xiàn) MCD復(fù)發(fā)患者尿液及腎小球中 CD80較緩解期增加,而 FSGS患者無此變化。本研究發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞 CnAα在 FSGS和MCD間的表達(dá)差異,也提示二者發(fā)病機(jī)制不同。對于臨床懷疑 FSGS而腎臟病理未見節(jié)段病變的患者,足細(xì)胞 CnAα陽性者應(yīng)高度考慮 FSGS。足細(xì)胞 CnAα檢測是否有助于診斷 FSGS,還有待進(jìn)一步擴(kuò)大病例或者行重復(fù)腎活檢驗證。

本研究發(fā)現(xiàn)部分 FSGS患者腎小球中 Cn高表達(dá),主要定位于足細(xì)胞而非系膜或內(nèi)皮細(xì)胞。為了避免腎小球足細(xì)胞數(shù)目對結(jié)果判斷的影響,我們選擇連續(xù)切片中的正切小球計數(shù),排除節(jié)段病變的影響,并以單個腎小球足細(xì)胞陽性百分率為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn),發(fā)現(xiàn)同等蛋白尿程度的 FSGS患者以塌陷型、細(xì)胞型、頂部型足細(xì)胞 CnAα表達(dá)增加顯著,個別伴壁層上皮細(xì)胞陽性,而經(jīng)典型陰性。盡管早期糖尿病小鼠和脂多糖干預(yù)的小鼠均表現(xiàn)為足突融合,腎小球病變輕微,但人 MCD并無 Cn表達(dá)上調(diào)。這從分子病理角度提示 FSGS與糖尿病腎病、MCD足細(xì)胞損傷的機(jī)制不同,且 FSGS本身為異質(zhì)性的臨床病理綜合征。T細(xì)胞免疫功能異常[19]和循環(huán)通透因子[20]在獲得性 FSGS發(fā)病中固然很重要,但激素治療 FSGS的完全緩解率不足 30%[2],表明非免疫因素參與 FSGS發(fā)生。目前已知遺傳因素如瞬時受體電勢蛋白通道 6(transient receptor potential channel 6,TRPC6)突變[21]、感染(如 HIV病毒)、代謝和血流動力學(xué)異常(如肥胖)、藥物(如帕米二磷酸鈉)、金屬鋰中毒等均能導(dǎo)致腎小球 FSGS樣病變。此外,足細(xì)胞 CnAα陽性的 FSGS患者伴有壁層上皮細(xì)胞 CnAα陽性,提示在某些因素的刺激下,壁層上皮細(xì)胞 Cn的活化可能參與了腎小球足細(xì)胞病變。Dijkman等研究發(fā)現(xiàn) FSGS節(jié)段病變處足細(xì)胞表型與壁層上皮細(xì)胞相似,表達(dá)細(xì)胞角質(zhì)蛋白[22]、P鈣粘素[23,24]。因此,進(jìn)一步對足細(xì)胞 Cn上調(diào)因素的體外研究將有助于對 FSGS病因機(jī)制的探討。

就 CnAα表達(dá)上調(diào)對足細(xì)胞的影響,我們進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)大部分足細(xì)胞 CnAα陽性患者腎小球synaptopodin表達(dá)減弱、不連續(xù),與 Faul等[5]體外研究的報道一致。Cn去磷酸化后的 synaptopodin而不易與 14-3-3蛋白結(jié)合,使后者易被 cathepsin L降解,導(dǎo)致足細(xì)胞骨架紊亂。有趣的是,少部分足細(xì)胞CnAα陽性患者腎小球 syanptopodin表達(dá)分布未見異常。這一方面提示體內(nèi) synaptopodin的表達(dá)可能同時受 CnAα、14-3-3蛋白、cathepsin L等多種因素調(diào)節(jié);另一方面提示FSGS患者中 CnAα還可能通過NFAT等其他途徑導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。Wang等[25]發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞內(nèi) NFAT信號通路的激活參與了小鼠蛋白尿和腎小球節(jié)段局灶硬化的發(fā)生,提示 TRCP6突變可能通過鈣離子激活 Cn/NFAT參與部分 FSGS患者的發(fā)病。Gq受體亦可激活 Cn/NFAT信號通路,上調(diào)環(huán)氧化物酶 2,導(dǎo)致足細(xì)胞壞死[26]。另外,Cn還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期介導(dǎo) FSGS中局部足細(xì)胞的增殖和去分化。CnAα基因敲除的小鼠腎組織中細(xì)胞周期蛋白激酶抑制物 P27增加[13]。FSGS患者中高表達(dá) CnAα的足細(xì)胞細(xì)胞周期是否異常有待進(jìn)一步證實。

進(jìn)一步探討足細(xì)胞 CnAα表達(dá)與 FSGS臨床指標(biāo)的關(guān)系發(fā)現(xiàn),足細(xì)胞 CnAα陽性患者血肌酐和尿RBP水平較高,而未見與蛋白尿程度、激素治療反應(yīng)等相關(guān)。下一步對足細(xì)胞 CnAα陽性的 FSGS患者中腎小管 Cn表達(dá)分布及小管間質(zhì)急慢性病變的分析,將會加深我們對 CnAα在 FSGS發(fā)病中的認(rèn)識。本研究納入病例數(shù)有限,FSGS患者足細(xì)胞 Cn表達(dá)增加與是否初治無關(guān)。初發(fā)激素治療患者例數(shù)有限,隨訪周期不夠,尚不能說明 FSGS患者中腎小球 Cn表達(dá)與激素治療反應(yīng)的關(guān)系。激素抵抗患者腎小球 Cn的表達(dá)檢測可能有助于二線治療方案的選擇。

綜上所述,部分FSGS患者足細(xì)胞CnAα表達(dá)增加,以塌陷型、細(xì)胞型、頂部型顯著,伴血肌酐升高。而 MCD患者腎小球 CnAα陰性。這提示 MCD和FSGS二者的發(fā)病機(jī)制不同,為 FSGS的發(fā)病提供了新線索。對臨床懷疑 FSGS而未見明確節(jié)段病變的患者,足細(xì)胞 CnAα的過表達(dá)有助于診斷。進(jìn)一步闡明 FSGS患者足細(xì)胞 CnAα表達(dá)增加的機(jī)制及其在腎組織損傷的作用,有助于 FSGS的正確診斷和合理治療。

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