王文,許棟明,相婕,李蕾,王培昌,艾厚喜,張麗,李林

缺血性腦損傷是危害人類健康的三大疾病之一。我國居民第三次死因調(diào)查結(jié)果顯示,腦血管病已成為我國第1位的死亡原因,死亡率高于歐美國家4～5倍,目前臨床上缺少有效的腦保護(hù)藥。中藥治療腦血管病有確切的臨床療效。我們從中藥山茱萸篩選到有效成分莫諾苷,前期細(xì)胞試驗表明,對神經(jīng)細(xì)胞SY5Y具有抑制過氧化氫損傷、抑制細(xì)胞凋亡、鈣超載等作用[1-9],有提高局灶性腦缺血再灌注大鼠皮層總抗氧化能力的作用[10]。本試驗研究莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠皮層超氧化物歧化酶及神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 莫諾苷由本室從山茱萸中提取制備,HPLC分析純度大于98.5%。維生素E(VE):北京雙鶴藥業(yè)。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒:南京建成生物工程研究所(批號:20081102)。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物分組及給藥 72只SPF級Wistar雄性成年大鼠,體重260～280 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,合格證編號:SCXK(京)2007-0001。隨機(jī)分為假手術(shù)組,模型組,莫諾苷小(30 mg/kg)、中(90 mg/kg)、大(270 mg/kg)劑量組和維生素E組(35 mg/kg),每組12只。采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,術(shù)后一半動物連續(xù)灌胃給藥3 d,另一半連續(xù)灌胃給藥7 d,每天給藥1次。

1.3 模型制備 局灶性腦缺血再灌注模型采用改良Zea Longa線栓法[3]制備。大鼠用10%水合氯醛0.35 ml/kg腹腔注射麻醉,仰臥位固定于鼠板上,頸部正中切口,鈍性分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈,結(jié)扎頸外動脈和頸總動脈的近心端,動脈夾與頸總動脈近心端之間結(jié)扎一道縫合線,不扎緊。在頸總動脈接近頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉處用眼科剪作一斜行細(xì)切口,將直徑為0.26 mm的尼龍線插入,稍扎緊縫合線,推動尼龍線進(jìn)入頸內(nèi)動脈,進(jìn)入距頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉處約2 cm時,會有阻擋感,說明栓線已越過大腦中動脈,到達(dá)大腦前動脈的起始部。記錄栓塞開始時間,結(jié)扎頸總動脈上端?？p合肌肉、皮膚。栓塞后2 h,若此時大鼠已蘇醒則需要再次將大鼠麻醉,并拔出尼龍線。假手術(shù)組的大鼠除不插入尼龍線外,其他操作與手術(shù)組相同。

1.4 模型成功及評價標(biāo)準(zhǔn) 參照 Longa及Bederon的5分制評分方法[3-4]對實驗動物的神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評分。0分:無神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀;1分:不能完全伸展對側(cè)前爪;2分:向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向?qū)?cè)傾斜;4分:不能自發(fā)行走,意識喪失。將0分、1分及4分大鼠剔除并補(bǔ)充各組設(shè)計所需大鼠數(shù)量。

1.5 SOD測定 腦缺血再灌注后3 d迅速斷頭取腦,冰生理鹽水快速漂洗,徹底去除標(biāo)本表面血液后,于冰盤上分離患側(cè)腦皮層組織。將大鼠患側(cè)腦皮層組織在電子天平上稱重后,用高速電動勻漿器在低溫下制成10%組織勻漿液。置低溫高速離心機(jī)內(nèi),12000 r/min離心30 min。SOD檢測按照試劑盒說明書進(jìn)行,并按試劑盒提供的公式進(jìn)行計算。

1.6 Nissl染色 再灌注7 d大鼠用體積分?jǐn)?shù)為0.04的甲醛行心臟灌注,取腦組織行石蠟包埋。組織切片經(jīng)脫蠟、逐級乙醇脫水及水洗后,加入緩沖亞甲蘭染液10 min,0.2 M乙酸鹽緩沖液(pH=4.6)分色2 min。陽性染色者胞核淡染,胞質(zhì)呈藍(lán)色,即存活的神經(jīng)元。

2 結(jié)果

2.1 SOD 模型組皮層SOD活性降低;與模型組相比,莫諾苷大劑量和VE組SOD活性顯著升高(P＜0.01,圖 1)。

2.2 腦神經(jīng)元 模型組神經(jīng)元數(shù)量明顯下降;與模型組比較,莫諾苷各組能明顯提高神經(jīng)元數(shù);VE組與模型組無顯著性差異(圖2)。

3 討論

缺血性腦血管病具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高的特點。尋找有效的預(yù)防措施以減少發(fā)病率、有效的腦保護(hù)措施以減少死亡率以及有效的再生修復(fù)措施以減少其致殘率和致殘程度是研究的關(guān)鍵。

缺血性腦損傷在急性期主要是由于能量障礙引起氧化應(yīng)急、鈣超載、興奮性氨基酸毒性,造成腦損傷。在這一階段,抗氧化、抑制鈣超載和興奮性氨基酸毒性是治療的關(guān)鍵問題。人體抗氧化主要有兩種方式,小分子抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶,其中由于氧化應(yīng)激而誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗氧化酶在這個過程中起著重要作用,它是體內(nèi)抗氧化能力的重要反應(yīng)。缺血再灌注3 d基本上能夠反映藥物在急性期抗氧化能力。本研究顯示,大劑量莫諾苷和經(jīng)典的抗氧化劑VE一樣,表現(xiàn)出很好的抗氧化活性,顯示有良好的應(yīng)用前景。

腦缺血/再灌注損傷在急性期另外一個病理過程是引起神經(jīng)元的死亡和凋亡,造成神經(jīng)元大量減少,造成神經(jīng)功能障礙。本研究顯示,大鼠腦缺血/再灌注后,口服莫諾苷7 d,可以抑制神經(jīng)元數(shù)量的減少,有神經(jīng)保護(hù)作用;而VE沒有抑制神經(jīng)元減少的作用,表明莫諾苷在抑制氧化應(yīng)激外,另有其他機(jī)理產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用,值得進(jìn)一步探討。

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