肖緒華綜述,趙永忠審校

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,廣西桂林541001)

結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種間質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)因子,具有明顯的絲裂原性和趨化性,可以啟動(dòng)一系列介導(dǎo)組織創(chuàng)傷修復(fù)和再生的生物學(xué)過(guò)程。作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factorβ1,TGF-β1)的下游反應(yīng)元件,CTGF 介導(dǎo) TGF-β 1 促組織纖維化的效應(yīng),而與TGF-β1抗炎、調(diào)節(jié)免疫等其他生物學(xué)效應(yīng)無(wú)明顯相關(guān),因此可能成為抗肝纖維化的更具特異性的靶點(diǎn),在探索抗纖維化的道路上愈來(lái)愈引起大家的關(guān)注。本文就CTGF與肝纖維化的研究進(jìn)展綜述如下。

1 CTGF概述

CTGF最早是在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的,它屬于一種即刻早期基因(CTGF Cyr61 Nov,CCN)家族成員之一?，F(xiàn)已證明 CTGF基因位于第 6號(hào)染色體長(zhǎng)臂(6q 23.1),相對(duì)分子量為 36 000～38 000,含 349個(gè)氨基酸殘基,是一種C端富含半胱氨酸肝素結(jié)合蛋白的分泌性多肽,廣泛表達(dá)于人類(lèi)心臟、胎盤(pán)、肺、肝臟及腎臟等多種組織器官中。大量研究表明,CTGF可由多種類(lèi)型的細(xì)胞產(chǎn)生,如胚胎組織、皮膚、腎小球系膜細(xì)胞、腎間質(zhì)細(xì)胞、肝及胰腺星狀細(xì)胞、血管內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞,表達(dá)量取決于組織細(xì)胞類(lèi)型及功能狀態(tài)。事實(shí)上,CTGF是TGF-β生物學(xué)作用的下游效應(yīng)介質(zhì),它在功能上與TGF-β具有很大的相似性,包括具有有絲分裂原效應(yīng),促使細(xì)胞增殖;促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成,抑制其降解,導(dǎo)致ECM的積聚及結(jié)構(gòu)改建;表達(dá)細(xì)胞黏附因子使細(xì)胞易黏附和結(jié)合基質(zhì)蛋白;具有趨化效應(yīng),在體外能趨化成纖維樣細(xì)胞,而這些效應(yīng)都與纖維化密切相關(guān)。相對(duì)TGF-β,CTGF的最大特點(diǎn)就是生物學(xué)功能比較單一,主要表現(xiàn)在對(duì)纖維化的影響[1]。另外,在對(duì) TGF-β應(yīng)答時(shí)CTGF可以調(diào)控關(guān)鍵的細(xì)胞事件,包括遷移、增殖、基質(zhì)產(chǎn)生和成纖維細(xì)胞收縮、分化成肌成纖維細(xì)胞,這些都是纖維化應(yīng)答事件[2]。說(shuō)明CTGF是重要的促組織纖維化蛋白,在組織纖維化的形成和發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。

2 CTGF在肝纖維化組織中的表達(dá)和作用

CTGF在正常肝組織中的表達(dá)很少,僅在間質(zhì)和肝血管有少量的表達(dá)[3]。但在肝纖維化動(dòng)物模型肝組織及慢性肝病患者肝組織中CTGF mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平增高,并與肝纖維化程度成正相關(guān)。Li等[4]運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法發(fā)現(xiàn),四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型組與對(duì)照組相比,CTGF蛋白和基因表達(dá)明顯增強(qiáng)。Hsu等[5]采用二甲基亞硝胺(DMA)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給予DMA 2～5周后大鼠肝組織中TGF-β1和CTGF mRNA高表達(dá),表達(dá)水平隨著肝纖維化程度積分的增加而逐漸升高。Abou-Shady等[6]用Northern印跡雜交(Northern blot)分析顯示,慢性病毒性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)、原因不明的肝病和酒精性肝病等患者的硬化肝臟中CTGF和TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平與正常人肝臟相比增加了6～8倍。Horac等[7]研究發(fā)現(xiàn)在伴有肝臟脂肪變和纖維化的慢性丙型肝炎患者組織中CTGF的表達(dá)明顯增強(qiáng),并認(rèn)為CTGF是獨(dú)立的致肝纖維化因子。Kobayashi等[8]對(duì)膽管閉鎖患者手術(shù)切除活檢標(biāo)本進(jìn)行了原位雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在膽管閉鎖患者肝組織中CTGF mRNA表達(dá)增高,特別是在肝細(xì)胞和星狀肝細(xì)胞(HSC)中表達(dá)明顯,而且表達(dá)與病變程度相關(guān)?？梢?jiàn)在慢性肝病患者及肝纖維化動(dòng)物模型肝組織中,CTGF mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平增高,程度與肝纖維化積分成正相關(guān),但與肝纖維化的類(lèi)型無(wú)關(guān)。

研究表明,在肝組織中CTGF的主要來(lái)源于HSC。Paradis等[9]檢測(cè)了原代培養(yǎng) 3 d(靜止?fàn)顟B(tài))、5 d(中間狀態(tài))和 7 d(活化狀態(tài))HSC的CTGF mRNA水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表達(dá)隨時(shí)間進(jìn)行性上調(diào),同時(shí)Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)在第3天和第5天上調(diào)了近12倍,而且Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)增長(zhǎng)相對(duì)滯后。結(jié)果證明HSC不僅能分泌CTGF而且提示CTGF可能對(duì)膠原基因表達(dá)具有調(diào)控作用。Gressner等[10]在培養(yǎng)的HSC和肝細(xì)胞兩種細(xì)胞系分別測(cè)定CTGF和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-SM A在激活HSC中表達(dá)升高,而CTGF表達(dá)不依賴于細(xì)胞激活轉(zhuǎn)化;并同時(shí)發(fā)現(xiàn)在被激活的肝細(xì)胞中CTGF強(qiáng)烈表達(dá),說(shuō)明肝細(xì)胞也可能參與了CTGF表達(dá)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,Tong等[11]通過(guò)將人CTGF基因轉(zhuǎn)到大鼠體內(nèi),使其表達(dá)CTGF基因和蛋白,通過(guò)與非轉(zhuǎn)基因大鼠比較發(fā)現(xiàn),單純的CTGF高表達(dá)并不能導(dǎo)致肝功能和肝組織學(xué)變化。但在給予CCl4以后,轉(zhuǎn)基因大鼠無(wú)論是血清透明質(zhì)酸水平還是肝組織中α-SM A、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MM P-2)和金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高。轉(zhuǎn)基因大鼠在膽總管結(jié)扎2周后也表現(xiàn)出了大量的膠原蛋白沉積。說(shuō)明體內(nèi)CTGF水平升高不會(huì)導(dǎo)致肝損傷或纖維化本身,而是呈現(xiàn)出肝臟更容易受其他致纖維化因素所傷害。這可能是由于CTGF與其他分子如 TGF-β1、纖維連接蛋白相互影響,對(duì)這些因子信號(hào)傳導(dǎo)起協(xié)同和放大的作用,CTGF的高表達(dá)改變了肝組織的微環(huán)境,增加了肝臟對(duì)損傷刺激的敏感性。這支持了CTGF在肝纖維化形成過(guò)程中的核心作用。

總之,激活的HSC可產(chǎn)生CTGF,而CTGF又可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、遷移、黏附和ECM的產(chǎn)生,誘導(dǎo)纖維化的產(chǎn)生[12]。CTGF還可能是多種纖維化信號(hào)通路下游的共同效應(yīng)因子,在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,因此被稱為肝臟疾病中扳動(dòng)纖維化產(chǎn)生的“總開(kāi)關(guān)”[13]。

3 CTGF與肝纖維化的診斷

肝纖維化主要靠肝組織穿刺活檢診斷,但由于這是一種侵入性檢查而且費(fèi)用高,因而限制了其廣泛使用,尋找一種良好的肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)具有很大的實(shí)用價(jià)值。大量研究表明CTGF在正常肝組織中僅有少量表達(dá),在肝纖維化時(shí)CTGF表達(dá)升高且與肝纖維化程度相關(guān)。因由體內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生的CTGF可以直接分泌到細(xì)胞外間隙,并進(jìn)入體循環(huán),因此使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血液中CTGF濃度被認(rèn)為是一種診斷和評(píng)估纖維化程度的一個(gè)良好指標(biāo)[14]。Kovalenko等[15]對(duì)138例丙型病毒性肝炎患者和129例慢性肝病患者血清CTGF水平進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙型病毒性肝炎患者和慢性肝病患者血清CTGF水平較正常人明顯增高,而且CTGF水平與肝纖維化程度和肝硬化分級(jí)有關(guān);且同時(shí)發(fā)現(xiàn)CTGF存在多種基因型。Gressner等[16]采用多層免疫分析法檢測(cè)了83例慢性肝病患者(包括17例慢性肝炎患者,16例組織學(xué)診斷為肝纖維化患者,50例肝硬化患者)和74例健康人的血清CTGF濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),慢性肝炎組、肝纖維化組和肝硬化組的血清CTGF濃度分別是健康對(duì)照組的4.3倍、5.2倍和3.2倍,說(shuō)明了CTGF與肝纖維化有關(guān);并發(fā)現(xiàn)硬化組的CTGF水平較纖維化組低,認(rèn)為CTGF濃度反映的是纖維化發(fā)展的程度,并非組織硬化程度,因此可作為進(jìn)展期肝纖維化程度的指標(biāo)。Zhang等[17]也做了類(lèi)似的研究,而且對(duì)患者的肝纖維化程度進(jìn)行了詳細(xì)的分級(jí),用ELISA檢測(cè)血清CTGF濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),健康人和慢性肝炎患者間、不同級(jí)別肝纖維化患者之間,CTGF濃度逐漸升高;說(shuō)明CTGF的濃度不僅與肝纖維化相關(guān)而且隨著肝纖維化程度的加重而升高,提示CTGF可能是診斷和反映肝纖維化程度的良好標(biāo)志物。

4 干擾CTGF表達(dá)與肝纖維化的基因治療

CTGF作為 TGF-β的下游介質(zhì),是一個(gè)比 TGF-β更具特異性的靶位。因此,針對(duì)CTGF的治療策略受到廣泛的關(guān)注。多項(xiàng)研究表明,針對(duì)CTGF轉(zhuǎn)錄水平的干擾可能是一種有效的抗肝纖維化的治療方法。Zhu等[18]將能在體內(nèi)自主合成短發(fā)夾狀RNA(shRNA)的pEGFP-CTGF表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HSCT6(一種鼠源性激活的HSC株),觀察其對(duì)CTGF mRNA及蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染 pEGFP-CTGF shRNA1的HSC-T6細(xì)胞CTGF的表達(dá)被干擾,顯著減少Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原、層黏蛋白(LN)和透明質(zhì)酸(HA)的形成。Li等[19]在HSC培養(yǎng)基中加入抗CTGF的小分子干擾RNA(siRNA),發(fā)現(xiàn)在HSC培養(yǎng)基中抗CTGF的 siRNA高效特異的抑制了CTGF的基因表達(dá),同時(shí)發(fā)現(xiàn)α-SMA表達(dá)顯著降低。在激活的HSC中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的mRNA的表達(dá)及上清液中HA濃度均降低。說(shuō)明siRNA能有效和特異性下調(diào)大鼠HSC的CTGF的表達(dá),顯著抑制HSC的活化和增殖并能有效抑制細(xì)胞外基質(zhì)生產(chǎn),應(yīng)用siRNA抑制CTGF基因表達(dá)可能是抗肝纖維化治療的一種有效的策略。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在加入siRNA大鼠原代HSC培養(yǎng)7 d(激活期)后,觀察到HSC G0/G1時(shí)相細(xì)胞比例明顯增多,表明siRNA沉默CTGF可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期靜止來(lái)抑制大鼠HSC增殖。誘導(dǎo)細(xì)胞周期靜止可能是siRNA沉默CTGF抑制大鼠HSC增殖的機(jī)制之一。

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,Uchio等[20]用CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的發(fā)生,以反義核苷酸對(duì)HSC的CTGF進(jìn)行RNA干擾,可減少CTGF、TGF-β和Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá),而 TIM P-1和纖維沉積的量沒(méi)有改變。說(shuō)明單純降低CTGF的水平雖可抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,但由于TIMP-1的持續(xù)高表達(dá),干擾CTGF表達(dá)抗纖維化治療的效果受到影響。Li等[4]應(yīng)用門(mén)靜脈注射CTGF siRNA的方法對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型進(jìn)行治療,結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA治療組Ⅰ、Ⅲ型膠原,LN、TIMP-1和TGF-β1的基因表達(dá)均減弱,活化的 HSC數(shù)量減少,α-SMA表達(dá)降低 ,血清中Ⅲ型前膠原、肝羥脯氨酸與肝纖維化程度均降低。George和Tsutsumi[21]發(fā)現(xiàn)在二甲基亞硝胺(DMA)所致的肝纖維化模型中,應(yīng)用CTGF siRNA治療后CTGF以及TGF-β1基因表達(dá)減弱,HSC的活化受抑制,肝臟中結(jié)締組織沉積減少。結(jié)果表明CTGF siRNA可以有效的預(yù)防和治療DMA所致的大鼠肝纖維化。

總之,沉默或干擾CTGF基因表達(dá)的方法在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出強(qiáng)烈而且特異的抑制ECM沉積的作用,抗CTGF的基因治療做為一種嶄新的抗纖維化手段,給抗纖維化治療帶來(lái)了新的思路,具有廣闊的應(yīng)用前景。

5 展 望

CTGF是調(diào)控器官纖維化的重要細(xì)胞因子,不僅直接調(diào)節(jié)HSC的活化和ECM的產(chǎn)生,而且可能是纖維化信號(hào)通路下游的共同效應(yīng)因子,在多種組織器官纖維化中起關(guān)鍵作用。另外,CTGF生物學(xué)作用比其上游控件TGF-β1更單一,主要局限在纖維化的發(fā)生方面。抑制CTGF表達(dá)的治療比抗TGF-β1更具針對(duì)性,而不影響 TGF-β1的抗炎、免疫抑制等重要生理作用。進(jìn)一步深入研究CTGF的基因表達(dá)調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)通路及致纖維化機(jī)制,將有助于探索更特異更有效的抗纖維化治療策略,為控制纖維化疾病帶來(lái)嶄新希望,具有重要的臨床意義。

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