黃銀燕 ，楊翠玲 ，李偉東 ，肖韻 ，王光 ，李鵬 ，陳遠(yuǎn)平 ，鐘杰平 ,*

（1.廣東海洋大學(xué)實驗教學(xué)部，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)理學(xué)院，廣東 湛江 524088；3.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088）

烏賊墨提取物對環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠肝功能的保護(hù)作用研究

黃銀燕1，楊翠玲2，李偉東2，肖韻2，王光3，李鵬3，陳遠(yuǎn)平2，鐘杰平2,*

（1.廣東海洋大學(xué)實驗教學(xué)部，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)理學(xué)院，廣東 湛江 524088；3.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088）

探討烏賊墨提取物對環(huán)磷酰胺所致肝損傷小鼠肝功能的保護(hù)作用，以及在不同濃度條件下的作用效果。40只BALB/C小鼠，隨機(jī)分成4組。觀察各組小鼠的肝重系數(shù)及肝組織中SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（過氧化氫酶）、GSH-Px（谷胱甘肽過氧化物酶）、MDA（丙二醛）和血液中SOD、MDA的變化。環(huán)磷酰胺能顯著的改變正常小鼠肝重系數(shù)（P＜0.05），不同程度的降低正常小鼠肝組織中 SOD,CAT,GSH-Px活力（P＜0.01或 P＜0.05）及 MDA 含量（P＜0.01），較低濃度的烏賊墨提取物均能不同程度的改變由環(huán)磷酰胺所致的正常小鼠肝組織中上述各項指標(biāo)的變化（P＜0.01或P＜0.05），而較高濃度的烏賊墨提取物對上述各項指標(biāo)的改善作用有所減弱，有的甚至沒有作用（P＞0.05），同樣的結(jié)果也在血液學(xué)指標(biāo)中有所體現(xiàn)。

烏賊墨提取物；環(huán)磷酰胺；肝功能；抗氧化

烏賊屬于軟體動物門，頭足綱，烏賊目，烏賊科，烏賊屬的一種海洋動物。烏賊墨是儲存于烏賊墨囊內(nèi)腔中，當(dāng)烏賊遇到天敵時噴出的一種防身物質(zhì)，可影響或者麻痹入侵者的視覺和嗅覺。烏賊墨可以通過影響纖溶系統(tǒng)降低纖溶酶活性，減少纖維蛋白的溶解促進(jìn)凝血[1]。近年來發(fā)現(xiàn)烏賊墨及其提取物具有抗腫瘤[2-4]，抗氧化[5-6]，降血脂[7]，增強(qiáng)免疫[8]等重要功能。在日本，人們將粉末狀或液狀烏賊墨熬好后滲入至食品中，目前，日本已經(jīng)有含有烏賊墨的面條、面包、小麥粉制的甜點心和魚糜制品面世，添加量在0.2%～1.5%之間。還有用烏賊墨和扇貝汁做成的烏賊墨湯面，由于其公認(rèn)的含有抗癌物質(zhì)，也因此自然地形成了一種簡易的健康食品，深受廣大消費者的歡迎。

我們采用腹腔注射環(huán)磷酰胺造肝損傷模型，通過口服灌胃烏賊墨提取物來觀察其是否對肝損傷小鼠的肝功能具有保護(hù)作用，進(jìn)而開發(fā)這種海洋廢棄物的食藥同源性，對于充分利用海洋資源，擴(kuò)大藥源有參考意義。

1 材料和方法

1.1 動物

健康的 BLAB/C 小鼠（SPF）,體重（20±2）g：購自廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心（合格證號：2007A035）。

1.2 試劑、儀器及藥物

環(huán)磷酰胺：江蘇恒瑞股份有限公司；MDA、SOD、CAT、GSH-Px測試試劑盒：南京建成生物工程研究所；722s可見光分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；烏賊：湛江市東豐市場；所有試劑均為分析純。

1.3 烏賊墨提取物的制備

取新鮮烏賊墨，加3倍體積冰冷的PBS（pH6.86）稀釋，研缽內(nèi)研磨，超聲波破碎，4℃，5000 r/min,離心20 min，上清液冷凍干燥成粉末，儲存于-80℃。樣品用生理鹽水稀釋到相應(yīng)濃度進(jìn)行灌胃。

1.4 分組、給藥及處理方法

小鼠隨機(jī)分為4組，雌雄各半，試驗期間均正常飲水,普通飲食。對照組（以每千克體重計）:灌胃生理鹽水（2.4 g）和腹腔注射生理鹽水（200 mg）；模型組（以每千克體重計）：灌胃生理鹽水（2.4 g）和腹腔注射環(huán)磷酰胺（200 mg）；低劑量組（以每千克體重計）：灌胃低濃度烏賊墨提取物（1.2g）和腹腔注射環(huán)磷酰胺（200mg）；高劑量組（以每千克體重計）：灌胃高濃度烏賊墨提取物（2.4 g）和腹腔注射環(huán)磷酰胺（200 mg），小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按上述分組情況給與灌胃生理鹽水和指定濃度的烏賊墨提取物10 d，然后連續(xù)腹腔注射生理鹽水和給定濃度的環(huán)磷酰胺3 d，在注射期間正常灌胃，此后繼續(xù)灌胃10 d，灌胃結(jié)束后次日處死小鼠，檢測各項指標(biāo)。環(huán)磷酰胺用生理鹽水配置。

1.5 指標(biāo)的測定

肝重系數(shù)=肝重/體重（mg/g）；MDA、SOD、CAT 和GSH-Px活力測定，均嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析。組間差異采用t-檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝重系數(shù)變化的比較

肝重系數(shù)的變化見圖1。

與對照組比較，環(huán)磷酰胺組能夠顯著地增大肝重系數(shù)（P＜0.05），與模型組比較，不同劑量的烏賊墨提取物又能不同程度的改善環(huán)磷酰胺的這種作用，其中低劑量組的作用極其顯著（P＜0.01）,高劑量組的作用反而有所減弱（P＜0.05）。

2.2 肝組織和血液中SOD活力的測定

肝組織和血液中SOD的變化如圖2和圖3。

與對照組比較，環(huán)磷酰胺組能夠顯著的降低肝組織中SOD活力（P＜0.05）和極其顯著地降低血液中SOD活力（P＜0.01）,與環(huán)磷酰胺組比較，不同濃度的烏賊墨提取物均能顯著地改善由環(huán)磷酰胺所致的肝組織中SOD活力降低的變化（P＜0.05），不同濃度間不存在顯著差異，而對于血液中SOD的影響低劑量組極其顯著（P＜0.01），高劑量組不顯著。

2.3 肝組織和血液中MDA含量的測定

肝組織和血液中MDA含量的變化見圖4和圖5。

與對照組比較，模型組能極其顯著地提高肝組織和血液中MDA含量（P＜0.01），同時，與模型組比較，較低濃度的烏賊墨提取物能夠顯著地改善環(huán)磷酰胺所致的這種MDA含量升高的作用（P＜0.05），而較高濃度的烏賊墨提取物改善作用不顯著 (P＞0.05)，而在血液中，低、高劑量組均能極其顯著地拮抗環(huán)磷酰胺的毒副作用（P＜0.01）。

2.4 肝組織中CAT活力的測定

肝組織中CAT活力的變化如圖6。

與對照組比較，環(huán)磷酰胺組能顯著地降低肝組織中CAT活力（P＜0.05），與模型組比較，較低濃度的烏賊墨提取物能顯著地改善這一變化(P＜0.05)，而高劑量組卻沒有明顯的改善作用(P＞0.05)。

2.5 肝組織中GSH-Px活力的測定

肝組織中GSH-Px的變化見圖7。

與對照組比較，環(huán)磷酰胺組能顯著的降低肝組織中GSH-Px的活力（P＜0.05），與模型組比較，低濃度的烏賊墨提取物能顯著的改變由環(huán)磷酰胺所致的小鼠肝組織中GSH-Px活力降低的作用（P＜0.05），較高劑量組的改善作用卻沒有顯著變化（P＞0.05）。

3 結(jié)論與討論

SOD是一種帶陰性電荷的金屬蛋白酶，主要功能是催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)，由于超氧陰離子常是活性氧生成過程中的初始產(chǎn)物，因此SOD也被看作為活性氧防御的第一線。CAT也是金屬酶，主要功能為催化過氧化氫分解為水和氧。GSH-Px的主要功能是催化還原型谷胱甘肽對過氧化物的還原反應(yīng)，進(jìn)而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用，他們的作用都是使機(jī)體免受自由基的攻擊。MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物,其含量的變化間接反映了組織中氧自由基含量變化,因此可通過測定MDA含量來評價組織中氧自由基的水平和脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)弱。

試驗表明環(huán)磷酰胺均能顯著的降低正常小鼠肝組織中SOD,CAT,GSH-Px活力，和升高正常小鼠肝組織和血液中MDA含量，說明這種應(yīng)激性肝損傷打破了自由基代謝的動態(tài)平衡,啟動自由基連鎖反應(yīng),使肝臟損傷程度加重。通過不同濃度烏賊墨提取物的灌胃，環(huán)磷酰胺模型小鼠肝組織內(nèi)的SOD,CAT,GSH-Px的活力均顯著提高，MDA含量顯著下降，均說明烏賊墨提取物對環(huán)磷酰胺所致的肝損傷小鼠的肝功能具有一定的保護(hù)作用，同時，試驗表明，高濃度的烏賊墨提取物的保護(hù)作用比低濃度烏賊墨提取物的作用要弱，有的甚至不起作用，至于高濃度的烏賊墨提取物是否具有一定的細(xì)胞毒性，還有待于進(jìn)一步研究。

另外，試驗結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺能顯著地增大正常小鼠的肝重系數(shù)，可能是產(chǎn)生的過多的自由基導(dǎo)致氧化應(yīng)激使肝臟代償性增大，或是由于肝細(xì)胞損傷導(dǎo)致的肝內(nèi)纖維生成與降解失衡，使肝內(nèi)膠原纖維含量增多而導(dǎo)致的肝重系數(shù)增大。經(jīng)過適當(dāng)濃度的烏賊墨提取物的灌胃能顯著地改變由環(huán)磷酰胺所致的正常小鼠肝重系數(shù)的變化。

[1]謝光臨,呂昌龍,洪明標(biāo),等.烏賊墨促凝血作用機(jī)制的實驗研究[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,1994,23(6):530

[2]Takaya Y,Uchisawa H,Matsue H,et al.An investigation of the antitumor peptidoglycan fraction from squid ink[J].Biol Pharm Bull,1994,17(6):846

[3]蘇偉明,馬潤娣,于立堅,等.中國槍烏賊墨汁提取物的抗腫瘤作用[J].中國海洋藥物雜志,2005,24(2):47

[4]劉成玉,滕青,周緒祥,等.烏賊墨對紅細(xì)胞免疫粘附腫瘤細(xì)胞能力的影響[J].中國海洋藥物雜志,1996(3):15

[5]陳士國,薛長湖,薛勇,等.魷魚墨黑色素的自由基清除活性研究[J].中國海洋藥物,2007,26(1):24

[6]張永軍,徐秀云,王保全,等.復(fù)方烏賊墨膠囊對小鼠SOD活性的影響[J].中國新醫(yī)藥,2003,2(1):32

[7]雷敏,王靜鳳,逄龍,等.烏賊墨對高脂血癥大鼠血脂代謝和抗氧化能力的影響[J].中國海洋藥物,2007,26(3):30

[8]赫甡,孟勝男,謝光麟.烏賊墨誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1的研究[J].中國海洋藥物,2003,22(5):17

Protective Effect of Sepia Ink Extract on Liver Function of Liver Injury Mice Induced by Cyclophosphamine

HUANG Yin-yan1，YANG Cui-ling2,LI Wei-dong2,XIAO Yun2,WANG Guang3,LI Peng3,CHEN Yuan-ping2,ZHONG Jie-ping2,*
（1.Modern Biochemistry Center,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088，Guangdong,China;2.College of Science,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088，Guangdong,China;3.College of Food Science&Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088，Guangdong,China）

To explore the protective effects of sepia ink extract on liver function of liver injury mice induced by cyclophosphamine,and the different result at the different concentration of sepia ink extract.A total of 40 mice were divided into 4 groups,control group,model group,low dose-and high dose-group.Model group was established with abdominally injection of cyclophosphamine.The activity of SOD,CAT,GSH-Px and the contents of MDA in liver and in blood and the index of liver was were observed.Compared with control group,cyclophosphamine changed significantly the index of liver（P＜0.05）,and incoordinately changed the activity of SOD,CAT,GSH-Px and the contents of MDA in liver and in blood（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with model group,the low dose-group,sepia ink also incoordinately changed the parameters induced by cyclophosphamine significantly（P＜0.05 or P＜0.01）.Whereas,the protective of the high concentration of sepia ink extract was reduce than the low dose-group on the changes,sometimes,it had no obvious effect（P>0.05）.The suitable concention of Sepia ink extract can play a definite protective role on liver function of liver injury mice.

sepia ink extract;cyclophosphamine;liver function;anti-oxidative

廣東省科技計劃項目（2008B021100014）；廣東海洋大學(xué)人才引進(jìn)項目；廣東海洋大學(xué)學(xué)生研究創(chuàng)新性實驗基金

黃銀燕（1965—），女（漢），實驗員，研究方向：海洋活性物質(zhì)的分離提取。

*通訊作者：鐘杰平，男，教授，研究方向：海洋應(yīng)用化學(xué)。

2009-07-07