田強(qiáng)，吳子健，黃道榮，王吰，張靜，付何蕾

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

葡萄籽中胰脂肪酶抑制物提取工藝

田強(qiáng)，吳子健*，黃道榮，王吰，張靜，付何蕾

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

以胰脂肪酶抑制率為響應(yīng)值，采用L25（56）正交設(shè)計(jì)和Box-Behnken試驗(yàn)法相結(jié)合的手段，研究自葡萄籽中提取可抑制胰脂肪酶活性產(chǎn)物的最佳工藝條件。研究結(jié)果表明：當(dāng)料液比為1∶8（g/mL）、乙醇濃度54%、浸提溫度67.6℃、浸提時(shí)間1.3 h時(shí)，葡萄籽提取物對(duì)胰脂肪酶的抑制率達(dá)61.53%以上。

葡萄籽浸提物；胰脂肪酶抑制物；最佳的浸提條件

針對(duì)人體消化系統(tǒng)中參與脂類代謝過程的酶類，特別是胰脂肪酶，選擇性篩選減肥保健食品、控制和減少脂肪吸收已經(jīng)成為治療肥胖的有效方法。大量來自天然植物的小分子物質(zhì)，如皂甙類物質(zhì)、多酚類物質(zhì)、萜類物質(zhì)等[1]都成為科研人員篩選可抑制胰脂肪酶活性或可進(jìn)一步成為天然減肥藥物的重要來源。其中，近年來國內(nèi)外研究表明來自葡萄籽的天然提取物可有效抑制胰脂肪酶活性，2003年，美國新澤西州立大學(xué)的Diego A.Moreno等[2]研究表明其可有效抑制脂肪酶的活性。2009年任秀娟等[3]，以及本課題組[4]分別研究和報(bào)道了從葡萄籽中提取有效物質(zhì)可作為胰脂肪酶抑制物，并且從酶動(dòng)力學(xué)的角度對(duì)胰脂肪酶活性的抑制率以及酶抑制類型做了較為深入的研究，研究結(jié)果表明：來自葡萄籽的抑制物對(duì)于胰脂肪酶活性的抑制作用屬于非競爭性抑制。

本文主要以提取物對(duì)胰脂肪酶抑制率作為衡量效應(yīng)因子，利用minitab軟件，以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與Box-Behnken法相結(jié)合研究自葡萄籽中提取可抑制胰脂肪酶活性產(chǎn)物的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料及試劑

葡萄籽：取自天津王朝葡萄酒廠；三丁酸甘油酯：Sigma公司；胰脂肪酶：Sigma公司；酚紅－麝香草酚藍(lán)混合指示液；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器

FW80型微型高速萬能粉碎機(jī)：天津市華鑫儀器廠；HSS1-B型恒溫水浴槽：成都儀器廠；RE52-98型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FA2004N型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；pH3-2B型pH計(jì)：上海雷磁電子儀器有限公司；WFJ7200型分光光度計(jì)：尤尼柯上海儀器有限公司；FDU-810型冷凍干燥機(jī)：EYELA日本東京理化；Sigma 3-18K型低溫高速離心機(jī)：INNOVA公司超低溫冰箱；等。

1.2 方法

1.2.1 葡萄籽浸提物的制備流程

葡萄籽→干燥→粉碎→過篩（30目）→正己烷脫脂2次（料液比1∶2.5，30 min/次）→備用的原料→乙醇浸提（3次）并離心，合并上清液→旋蒸濃縮（45℃）→真空冷凍干燥→胰脂肪酶抑制物→測定多酚含量及其對(duì)胰脂肪酶活力的抑制性

1.2.2 總多酚含量測定[5]

總多酚含量的測定按照Folin-Ciocalteu法。

1.2.3 胰脂肪酶活力的測定[4]

脂肪酶活力單位定義為：37℃，pH為7.5條件下，脂肪酶每分鐘水解三丁酸甘油脂生成1 μmol脂肪酸所需的酶量，為1個(gè)活力單位。

1.2.4 葡萄籽浸提物對(duì)胰脂肪酶抑制活性的測定[4]

1.2.5 正交試驗(yàn)法確定影響葡萄籽中胰脂肪酶抑制物浸提率的主要因素

為有效地從葡萄籽中提取對(duì)胰脂肪酶的活性具有抑制作用的有效成分，試驗(yàn)中以葡萄籽浸提物對(duì)胰脂肪酶的抑制率為提取條件的響應(yīng)，并采用L25（56）正交設(shè)計(jì)作為過程優(yōu)化的初步試驗(yàn)考察對(duì)抑制物的提取具有影響的因素：乙醇濃度、料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間，以確定各因素對(duì)響應(yīng)值影響的重要性和最大響應(yīng)區(qū)域。

1.2.6 Box-Behnken試驗(yàn)法確定葡萄籽中胰脂肪酶抑制物的最佳提取條件

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，針對(duì)胰脂肪酶抑制物提取影響較大的因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化提取最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)法確定影響葡萄籽中脂肪酶抑制物提取率的主要因素

正交試驗(yàn)方案如表1所示，結(jié)果及分析見表2，表3。

表1 葡萄籽胰脂肪酶抑制劑提取條件篩選的正交試驗(yàn)因素與水平表Table1 Factors and levels of orthogonal experiments

由表3的結(jié)果可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，在影響酶抑制效果的諸提取因素中，料液比不顯著，而乙醇濃度、浸提溫度和浸提時(shí)間均對(duì)酶抑制效果有顯著影響，各顯著因素影響次序?yàn)椋航釡囟?乙醇濃度>浸提時(shí)間，提取的最佳條件為A3B2C4D5附近。

表2 葡多酚提取條件篩選試驗(yàn)方案、試驗(yàn)結(jié)果及分析計(jì)算表Table2 Design and result of orthogonal experiment

表3 葡萄籽中胰脂肪酶抑制物提取條件篩選試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table3 Variance analysis

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化提取條件

利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)能夠確定各因素對(duì)提取率影響的重要性，并找到有利于葡萄籽中胰脂肪酶抑制物提取的最大響應(yīng)區(qū)域，但它不能在給出因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確函數(shù)表達(dá)式，即回歸方程，從而無法找出影響因素的最佳組合和響應(yīng)面值的最優(yōu)值。于是采用Box-Behnken試驗(yàn)法進(jìn)一步考察了它們對(duì)葡多酚提取及其對(duì)脂肪酶的抑制率的影響，利用minitab軟件設(shè)計(jì)了試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了分析。并對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果，在選定料液比為1∶8的前提下，選擇 3個(gè)因素：乙醇濃度（X1）、浸提溫度（X2）、浸提時(shí)間（X3）為自變量，以提取物對(duì)脂肪酶的抑制率為響應(yīng)值，利用minitab軟件設(shè)計(jì)了Box-Behnken試驗(yàn)（如表4所示），并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了回歸分析以及相應(yīng)的方差分析（如表5和表6所示）。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table4 The Box-Behnken experiment design and response values

表5 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析Table5 Result of regression analysis of the Box-Behnken design for inhibition rate

表6 酶活抑制率回歸模型方差分析Table6 Variance analysis of regression model for inhibition percentage

采用minitab軟件對(duì)表4中的葡萄籽浸提物對(duì)胰脂肪酶的抑制率數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到各影響因子的偏回歸系數(shù)及其顯著性（表6）。

從表5、6可以看出，3個(gè)因素在一定范圍內(nèi)對(duì)脂肪酶的抑制效果的影響均非常顯著，且交互作用也很顯著，F(xiàn)值為62.23，多元相關(guān)系數(shù)為R-Sq=99.12%，說明該模型對(duì)實(shí)際情況擬合較好，模型高度顯著，可用來進(jìn)行響應(yīng)值預(yù)測。

運(yùn)用Minitab軟件的響應(yīng)優(yōu)化器（Response Optimizer）計(jì)算出各提取條件的最優(yōu)解并繪圖，如圖1所示。

由圖1可直觀得出最優(yōu)提取工藝為乙醇濃度54%、浸提溫度67.6℃、浸提時(shí)間1.3 h時(shí)，提取產(chǎn)物對(duì)脂肪酶活抑制率達(dá)61.53%。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照優(yōu)化后的提取條件：乙醇濃度54%、浸提溫度67.6℃、浸提時(shí)間1.3 h、料液比為1∶8，進(jìn)行了脂肪酶抑制劑提取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)測酶抑制率達(dá)到62.02%，與預(yù)測值61.53%較接近，預(yù)測精度達(dá)96.56%，表明了正交試驗(yàn)和Box-Behnken方法聯(lián)用的可行性，也證明了該套統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析方法在生物加工過程應(yīng)用中的準(zhǔn)確性和可靠性。

3 結(jié)論

葡萄籽中提取的多酚類成分對(duì)脂肪酶有明顯的抑制作用。以抑制率為響應(yīng)得出最佳提取條件為料液比為1∶8、乙醇濃度54%、浸提溫度67.6℃、浸提時(shí)間1.3 h，在該條件下的提取物對(duì)脂肪酶抑制率達(dá)61.53%以上，該參數(shù)為自葡萄籽制備脂肪酶抑制劑的中試生產(chǎn)提供了參考。

[1]Rahul B Birari,Kamlesh K Bhutani.Pancreatic lipase inhibitors from natural sources:unexplored potential[J].Drug Discovery Today,2007,12(19/20):879-889

[2]Moreno D A,Ilic N,Diego A.Alexander Poulev，et al.Inhibitory effectsofgrapeseedextractonlipases[J].Nutrition，2003,19(10):876-879

[3]任秀娟,馬海樂.葡萄籽提取物脂肪酶抑制活性篩選及抑制機(jī)理的研究[J].食品工業(yè)科技,2009,30(6):181-186

[4]吳子健,王吰,鄭俊清,等.葡萄籽浸提物對(duì)胰脂肪酶活性抑制的研究[J].食品研究與開發(fā)，2009,30(9):83-86

[5]王宏.蘋果渣中多酚物質(zhì)的提取、分離、及其抗氧化活性的研究[D].陜西師范大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006:26-28

Optimizing Conditions for the Isolation of Pancreatic Lipase Inhibitive Substance from Grape Seeds

TIAN Qiang,WU Zi-jian*,HUANG Dao-rong,WANG Hong,ZHANG Jing,FU He-lei
（School of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology,Tianjin 300134,China）

In order to optimize the extraction condition of pancreatic lipase inhibitive substance for grape seed（GS）,the combination of orthogonal design（L25（56））and Box-Behnken design is performed,taking pancreatic lipase inhibition rate as response value.The results show that,when ratio of CGS powder to extractant（ethanol）is 1 to 8,the concentration of ethanol is 54%,the extraction temperature is 67.6℃,and extraction time is 1.3 h,the optimal inhibitive rate of CGS extract to pancreatic lipase（61.53%）is realized.

grape seed extracts;pancreatic lipase inhibitors;optimal extraction condition

天津商業(yè)大學(xué)青年科研培育基金項(xiàng)目（080109）

田強(qiáng)（1956—），男（漢），講師，學(xué)士，研究方向：工業(yè)微生物育種及活性產(chǎn)物提取。

*通訊作者

2009-11-02