胥彩云，童軍茂，周曉宏

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.北京理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100081）

胰酶水解豬皮膠原蛋白及其產(chǎn)物氨基酸分析

胥彩云1，童軍茂1，周曉宏2,*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.北京理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100081）

采用胰酶水解豬皮膠原蛋白，研究其降解規(guī)律及酶解產(chǎn)物氨基酸組成。研究表明：95℃熱處理豬皮膠原蛋白10 min能顯著提高酶解速率；整個(gè)酶解過程中，可溶性氮、氨肽氮含量呈增加趨勢(shì)，但3h后增勢(shì)變緩，而肽含量在3h后達(dá)到最大值；大部分不溶性蛋白在酶解6 h后已經(jīng)變成可溶性多肽和氨基酸；從酶解產(chǎn)物氨基酸組成可表明，采用胰酶水解豬皮膠原蛋白能顯著提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

豬皮膠原蛋白；熱變性；酶解；氨基酸分析

動(dòng)物皮膚最重要的一個(gè)應(yīng)用就是制革，但是由于豬皮本身的質(zhì)地不佳，目前在皮革工業(yè)中已經(jīng)很少采用豬皮，發(fā)展豬皮深加工是豬皮加工業(yè)的必然趨勢(shì)。豬皮中約含水分70%～75%[1]，蛋白質(zhì)21%～23%，脂肪1%，灰分0.5%。豬皮中的蛋白質(zhì)以膠原蛋白為主，含量為87.7%。膠原蛋白具有獨(dú)特的三股超螺旋結(jié)構(gòu)，三條鏈相互平行而且由鏈間氫鍵相連[2]，具有十分穩(wěn)定的性質(zhì)，一般的加工溫度及短時(shí)間加熱都難使其分解，因此難被人體吸收，食用利用率較低[3]，將膠原蛋白水解為多肽后，其營(yíng)養(yǎng)及生理功能可顯著提高：蛋白質(zhì)消化吸收率幾乎達(dá)100%，能保護(hù)胃黏膜以及抗?jié)儯龠M(jìn)皮膚膠原代謝，抑制血壓上升，對(duì)關(guān)節(jié)炎等膠原病具有很好的預(yù)防及治療作用，能促進(jìn)鈣吸收和降低血清中膽固醇含量等[4-6]。膠原蛋白的水解及膠原多肽的利用一直是科學(xué)工作者研究的一個(gè)熱門課題。因此，利用酶技術(shù)處理豬皮制備膠原蛋白是提高其資源利用率和附加值的有效途徑。目前對(duì)豬皮酶水解的研究集中在水解工藝條件的摸索方面，班玉鳳等[7]確定了Alcalase對(duì)豬皮膠原蛋白水解的最優(yōu)條件，王川，李燕等研究了用胰酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶從豬皮中提取膠原蛋白，其中以胰酶提取物得率最高，但結(jié)構(gòu)破壞較嚴(yán)重，用胃蛋白酶提取的膠原蛋白制品的結(jié)構(gòu)最完整，色澤最為潔白，但得率最低[8]。本文采用胰酶氮存在形式、肽分子量分布變化規(guī)律以及水解產(chǎn)物的氨基酸組成，為酶技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)具高附加值的豬皮深加工制品(如復(fù)合氨基酸和活性肽等)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

豬皮購(gòu)于北京市中關(guān)村家樂福超市（凍藏）刮脂、洗凈、繳碎，裝袋，置于-18℃冰箱中冷凍，試驗(yàn)前從冰箱中取出在流動(dòng)的自來水中緩化解凍，備用。

胰酶（Trypsin-chymotrypsin）由丹麥NOVO公司提供。

1.2 主要儀器設(shè)備及試劑

MM12型絞肉機(jī)：廣東省韶關(guān)市食品機(jī)械廠；CU600型電熱恒溫水箱：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KDN-2C型定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-2000型分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

試驗(yàn)中所采用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 分析方法

氨態(tài)氮含量：水解液中游離氨基酸含量占原料中總蛋白質(zhì)含量百分比，采用甲醛電位滴定法[9]分析；可溶性氮含量：水解液中蛋白質(zhì)含量占原料中總蛋白質(zhì)含量百分比，采用微量凱氏定氮法分析；肽基氮含量：水解液中肽含量占原料中總蛋白質(zhì)含量百分比，即可溶性氮含量與氨基氮含量之差；氨基酸組成分析：日立835-50型氨基酸自動(dòng)分析儀。

1.4 豬皮水解工藝

酶作用條件采用前期正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果。取解凍后豬皮50 g，加100 g蒸餾水勻漿1 min，調(diào)節(jié)初始pH至8.5，升溫至37℃，加入0.3 g胰酶，于水浴上恒溫?cái)嚢璺謩e水解 2、4、6 、8、10 、12 h 。酶解完畢，將酶解液于沸水浴中滅酶 20 min，離心（4800 r/min，20 min）過濾，所得濾液為酶解產(chǎn)物。其中未水解樣為豬皮勻漿后直接離心過濾的濾液部分，即豬皮水溶性提取物。所有樣品均稀釋至240 g用于分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對(duì)胰酶水解豬皮膠原蛋白的影響

分別取豬皮50 g，加入100 g水勻漿1 min，分別于溫度為 70、80、90、100 ℃水浴中保溫 10 min，然后按照1.4工藝水解2 h。不同溫度處理后豬皮膠原蛋白胰酶水解產(chǎn)物中氨態(tài)氮、可溶性氮以及肽基氮含量見圖1。

由圖1可以看出，水解時(shí)間相同時(shí)，隨著熱處理溫度的增加，豬皮膠原蛋白胰酶酶解產(chǎn)物中可溶性氮、氨基氮含量呈增高趨勢(shì)，即熱變性溫度越高，豬皮膠原蛋白消化率越高，70℃以后，這種趨勢(shì)更加明顯。膠原蛋白的分子量約為300000～360000，它是由3條肽鏈盤繞而成的三股螺旋結(jié)構(gòu)[10]，但熱處理使三股螺旋解旋而成游離多肽鏈，破壞分子間的共價(jià)交聯(lián)，引起膠原中鍵的隨機(jī)水解，變成大分子明膠，肖和蘭等[11]運(yùn)用傅里葉紅外光譜法（FTIR）和二維相關(guān)分析（2D correlation analysis）技術(shù)研究也發(fā)現(xiàn)，在15℃～95℃升溫過程中，膠原的3條螺旋肽鏈之間的氫鍵減弱，逐漸解螺旋，每條肽鏈因伸直而使其螺旋度減少，整個(gè)蛋白的變化能微擾并引起膠原蛋白結(jié)構(gòu)的變化。以上研究與本試驗(yàn)結(jié)論一致，原蛋白質(zhì)分子致密的立體結(jié)構(gòu)有礙于蛋白酶與底物的結(jié)合，熱處理使其成為松散的結(jié)構(gòu)，暴露原來包埋于內(nèi)部的作用位點(diǎn)，從而加速了水解速率。

圖1 不同熱處理溫度對(duì)豬皮膠原蛋白Trypsin-chymotrypsin酶解產(chǎn)物中氮存在形式影響Fig.1 Effects of different temperatures on N-forms in Pigskin collagen-Trypsin-chymotrypsin hydrolysates

2.2 胰酶水解豬皮膠原蛋白過程中氮存在形式變化規(guī)律

由圖1可知，在90℃～100℃之間加熱預(yù)處理可加速胰酶對(duì)豬皮膠原蛋白的水解速率，所以采用胰酶水解豬皮膠原蛋白時(shí)先于95℃處理底物10 min。再將豬皮勻漿按照酶解工藝水解不同時(shí)間，其產(chǎn)物中氨態(tài)氮、可溶性氮以及肽基氮含量見圖2。

圖2 胰酶水解豬皮膠原蛋白過程中氮形式變化Fig.2 Changes of N-forms during hydrolysis of Pigskin collagen by Trypsin-chymotrypsin

由圖2可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解產(chǎn)物中可溶性氮、游離氨基酸含量不斷地增加，且都在水解3h內(nèi)增速最快，隨后增勢(shì)變緩；而肽含量也是在水解3h內(nèi)增速最快，這表明這段時(shí)間胰酶主要以豬皮膠原蛋白為底物，酶解3h時(shí)肽含量達(dá)到最大值，隨后下降，這是由于酶解過程中同時(shí)存在著豬皮膠原蛋白降解成肽和氨基酸以及這些肽被進(jìn)一步降解成更小分子量的肽和氨基酸兩個(gè)過程，這兩個(gè)過程在酶解過程中某一時(shí)間段孰占優(yōu)勢(shì)對(duì)產(chǎn)物中肽的含量有直接的影響，酶解后期，胰酶主要以產(chǎn)物中存在的肽為底物，釋放出更小分子量的肽和氨基酸，因此肽的含量表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。

2.3 胰酶水解豬皮膠原蛋白產(chǎn)物氨基酸分析

一般蛋白質(zhì)含有20種氨基酸，膠原含有18種氨基酸[12-13]，有其特別的組成。由表1可見膠原的氨基酸組成的一些特點(diǎn)。

表1 膠原蛋白水解時(shí)間對(duì)氨基酸含量的影響Table 1 Comparison of amino acid composition in collagen-Trypsin-chymotrypsin hydrolysates at various hydrolysis time%

絕大多數(shù)蛋白質(zhì)中脯氨酸含量很少，而膠原蛋白中脯氨酸和羥脯氨酸的含量是各種蛋白質(zhì)中最高的，這兩種氨基酸都是環(huán)狀氨基酸，鎖住了整個(gè)膠原分子，使之很難拉開，故膠原具有微彈性和很強(qiáng)的拉伸強(qiáng)度。

膠原中缺少胱氨酸和色氨酸，只說明膠原是一種不完全蛋白。從營(yíng)養(yǎng)學(xué)意義上講，膠原是一種硬蛋白，3條肽鏈之間鍵合牢固，人和動(dòng)物很難消化吸收，因此將膠原蛋白酶法水解后，將膠原的3條肽鏈拆開，成為游離的多肽，進(jìn)而逐步水解成為小肽和游離的氨基酸，消化吸收率大大提高。

可見，豬皮膠原蛋白經(jīng)胰酶水解處理后能顯著提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

3 結(jié)論

胰酶水解豬皮膠原蛋白研究表明：熱處理豬皮膠原蛋白大大提高酶解速率：熱處理后，酶解液中可溶性氮含量由63.5%增加至87.9%；氨態(tài)氮含量由10.8%增加至37.9%。在整個(gè)酶解過程中，可溶性氮、游離氨基酸含量呈增加趨勢(shì)，前3h內(nèi)增勢(shì)較快，但3h后增勢(shì)緩慢，而肽含量在水解3h達(dá)到最大值48.1%。大部分不溶性蛋白在酶解4 h后已經(jīng)變?yōu)榭扇苄远嚯暮桶被?，蛋白質(zhì)的溶解過程基本結(jié)束。酶解12 h～48 h各時(shí)間段酶解產(chǎn)物中18種氨基酸含量略有變化，但氨基酸種類無變化。表明采用胰酶水解豬皮膠原蛋白能顯著提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。豬皮膠原蛋白胰酶水解產(chǎn)物中各肽段的具體生理活性、功能性有待進(jìn)一步研究。

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Trypsin Hydrolysis Pigskin Collagen and its Amino Acid Analysis

XU Cai-yun1,TONG Jun-mao1,ZHOU Xiao-hong2,*

（1.College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang,China；2.School of Life Science and Technology,Beijing Institute of Technology，Beijing 100081，China）

Pigskin collagen was hydrolyzed by Trypsin-chy motry psin to explore the degrading pattern and the amino acid composition of the resultinghydrolysate.The results showed that heat Pigskin collagen 10 min at 95℃was advantageous to enzymatichydrolysis of Pigskin collagen.Content of soluble nitrogen and amino nitrogen kept on increasing during hydrolysis,but increased slowly after 3h hydrolysis.Peptide content reached a maximum after 3h hydrolysis.A majority of unsoluble protein and peptides were degraded into soluble peptidesand amino acids after 6 h hydrolysis,acid composition in Pigskin collagen hydrolysate suggested that Pigskin collagen hydrolyzed by Trypsin-chymotrypsin improved the nutritional value of Pigskin collagen greatly.

pigskin collagen；heat denaturation；enzymatic hydrolysis；aminoacidanalysis

胥彩云（1983—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

*通信作者

2009-09-17