王海燕，蘇建輝，王子華，詹杰鵬，向本春，黃先忠，鄭銀英

北疆抗蟲棉Bt毒蛋白在棉蚜食物鏈中的動態(tài)研究

王海燕，蘇建輝，王子華，詹杰鵬，向本春，黃先忠，鄭銀英

（石河子大學(xué)生命科學(xué)院∕石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，石河子832003）

利用ELISA法檢測了抗蟲棉益農(nóng)二號不同時期葉片中的Bt蛋白的含量，以及棉田中棉蚜和龜紋瓢蟲體內(nèi)Bt蛋白的含量；利用室內(nèi)Bt棉葉片飼養(yǎng)試驗，觀測棉蚜和龜紋瓢蟲的生命參數(shù)。結(jié)果表明：抗蟲棉真葉中Bt毒蛋白的含量隨棉株發(fā)育而增加：從三葉期的121 ng／g增加到盛花期的304 ng／g，但子葉的含量高于早期的真葉。相應(yīng)地，在抗蟲棉田中的棉蚜和龜紋瓢蟲體內(nèi)均檢測到了Bt毒蛋白的存在。棉蚜體內(nèi)最高檢測到6 ng／g的水平，平均含量2.8～3.7 ng／g；而龜紋瓢蟲中Bt的含量高于棉蚜：四齡幼蟲平均為8.4 ng／g，雌性成蟲體和雄性成蟲分別為16.9 ng／g和27.8 ng／g。Bt棉上的棉蚜若蟲繁殖力和蛻皮率略高于常規(guī)棉，若蟲生長歷期縮短0.5 d左右；用Bt棉田的棉蚜飼喂的龜紋瓢蟲，其生長發(fā)育、存活率以及繁殖力等未受到影響。

抗蟲棉；Bt毒蛋白；棉蚜；龜紋瓢蟲；ELISA

隨著轉(zhuǎn)基因工程的快速發(fā)展，我國轉(zhuǎn)基因棉花種植面積每年以10%呈持續(xù)性增長。據(jù)James統(tǒng)計，2009年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已增長至1.34億h m2，其中轉(zhuǎn)基因棉花種植面積占49%［1］，據(jù)我國農(nóng)業(yè)部最新統(tǒng)計，我國Bt棉的種植面積已經(jīng)達到380萬h m2，約占棉花種植總面積的70%，而新疆Bt棉種植面積卻占全國Bt棉的51%。這種種植的快速增長趨勢，確實引起了人們對生態(tài)環(huán)境安全性問題的廣泛關(guān)注，Bt棉對非靶標生物的影響已成為生態(tài)風險評價的焦點之一［2］。直接或間接取食轉(zhuǎn)基因Bt棉后，有可能對植食者或天敵產(chǎn)生一些不良影響，對自然界的生態(tài)系統(tǒng)造成一種新的植物－植食者－天敵三者食物鏈格局奠定了一定的基礎(chǔ)。

目前，已有不少關(guān)于轉(zhuǎn)Bt基因的植物對非靶標生物和天敵的影響報道［2］，如Bt棉田的生物種群群落的動態(tài)趨勢或在室內(nèi)條件下對供試對象的生物學(xué)特性的影響，然而Bt殺蟲蛋白能否在轉(zhuǎn)基因植物－非靶標植食者－天敵三者間進行傳遞與富集并未進行深入的探究。

迄今為止，已有報道證實Bt殺蟲蛋白在植食者體內(nèi)的存在與轉(zhuǎn)移［3－5］。對于Bt蛋白的傳遞過程及其對其他生物的影響非常值得我們深入探究。為此，本文主要通過ELISA（enzy me linking i mmunosor bent assay）法，對新疆北疆地區(qū)廣泛種植的Bt棉（益農(nóng)二號）的Bt蛋白的定性定量檢測的基礎(chǔ)上，進一步研究了Bt蛋白在Bt棉－非靶標害蟲－天敵這一食物鏈中是否存在傳遞效應(yīng)以及Bt棉是否對昆蟲的生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 供試棉花品系和種植管理

本實驗所用的抗蟲棉（Gossypiu m.hirsut u m L.）益農(nóng)二號（伊陸早16號）購自益農(nóng)種苗公司。對照棉為新疆北疆地區(qū)廣泛種植的新陸早33號常規(guī)棉。

實驗于2010年在石河子大學(xué)實驗站試驗田進行。2010年4月30日播種，種植面積為0.5 h m2，地膜覆蓋。各品系播種量：伊陸早16號15 kg／h m2，新棉33號12 kg／h m2（脫絨后的質(zhì)量）。整個生長期，棉花不使用農(nóng)藥，除防治其他害蟲嚴重時應(yīng)予以適當噴灑農(nóng)藥，不打頂，不摘邊心，其他都為常規(guī)管理。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附法

Bt蛋白含量和定性分析按照美國Envir ol ogix公司酶聯(lián)免疫吸附法的檢測試劑盒（Quali Pate T M kit for CryIAb／CryIAc）說明書進行。

本試劑盒包含的試劑：抗體包被的96孔酶標生測板、CryIAb／Cr yIAc陽性對照，CryIAb／Cr yIAc酶連接物及顯色底物，1 mol／L HCl的終止液，1 L的PBS緩沖液的試劑包，1倍PBST（磷酸鹽，含0.05%吐溫－20）緩沖液，6種試劑均在4℃保存。

吐溫－20常溫保存，抽提緩沖液PBSE（磷酸鹽，含0.55%吐溫－20），現(xiàn)用現(xiàn)配該試劑盒在植物組織中Bt蛋白最低檢測量為0.04 ng／mL F W（鮮重）。

Bt蛋白含量在伯樂公司Model 550酶標儀450 n m波長下測定，測定時以每毫升含有0.375、0.6、0.75、1.5、3.0和6.0 ng純化蛋白（Cr yIAb／Cr yIAc蛋白標樣）做標準曲線（陽性對照），以常規(guī)棉品系新棉33號作為陰性對照。樣本中Bt毒蛋白的濃度以每克鮮重所含有的Bt毒蛋白的納克數(shù)表示（ng／g樣本鮮重）。

1.3 棉花不同時期葉片的采集及Bt蛋白含量檢測

采集棉花不同生長期（子葉期、三葉期、七葉期、盛花期）的葉片，在棉田將每個時期的葉片樣品以棋盤式20點取樣，每點1株，共采集100 mg初展嫩葉，－70℃保存。每個樣品共重復(fù)3次。加入少量液氮磨碎葉片樣品，然后按1∶100（w／v）比例加入預(yù)冷抽提緩沖液（PBST，p H＝7.4）。勻漿液于4℃過夜抽提后，4℃，12 000 r／min，離心10 min，樣品－70℃保存，待測。

1.4 大田昆蟲的收集及體內(nèi)Bt蛋白含量檢測

6月中旬至7月下旬，在棉田采用隨機抽樣法多株收集50頭棉蚜（體態(tài)大小基本一致的成蟲）至1.5 mL離心管內(nèi)，并稱重；室內(nèi)蚜蟲的收集過程同上。同時隨機采集龜紋瓢蟲的幼蟲（3～4齡）和雌、雄成蟲各20頭（單頭稱重－70°保存）；同時期的樣品共重復(fù)3次；將樣品在液氮中速凍30 s后，用研磨棒將其磨碎，每頭棉蚜以1∶20μL，每頭龜紋瓢蟲以1∶100μL，用PBST（p H＝5.8，冰預(yù)冷）緩沖液4℃過夜抽提，4℃，12 000 r／min，離心10 min，樣品－70℃保存，待測。

1.5 室內(nèi)昆蟲飼養(yǎng)的觀測實驗

室內(nèi)昆蟲材料主要來自2009年春季試驗棉田收集的棉蚜、2010年六月上旬棉田收集的龜紋瓢蟲的卵，將這兩種昆蟲材料進行人工室內(nèi)養(yǎng)殖，用于室內(nèi)Bt蛋白含量檢測和生長發(fā)育繁殖的觀察實驗。

棉蚜的室內(nèi)養(yǎng)殖采用單頭棉蚜子葉葉片法［6］和大量棉蚜的網(wǎng)套養(yǎng)殖法［7］。分別用益農(nóng)二號和新棉33號子葉葉片飼養(yǎng)的蚜蟲各50頭，每12 h觀察并記錄幼蟲的蛻皮率、存活率、各齡若蟲歷期，單頭雌蚜的終生產(chǎn)卵量。用網(wǎng)套養(yǎng)殖法擴繁的棉蚜用于伺喂龜紋瓢蟲。

龜紋瓢蟲的室內(nèi)養(yǎng)殖法參照張桂芬［5］報道，益農(nóng)二號和新棉33號各60頭，每天觀察并記錄幼蟲蛻皮率，每齡歷期，各齡期的重量，存活率，蛹化率及直到成蟲成熟后的隨機配對日產(chǎn)卵量（高峰期）和整個生命期的存活時間。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Cur ve Expert1.3軟件繪制Bt蛋白的標準曲線，用Excel 7.0繪圖，用SPSS16.0處理試驗中各種數(shù)據(jù)，采用單一變量T方檢驗［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗蟲棉不同時期葉片Bt毒蛋白的表達量

抗蟲棉不同時期葉片Bt蛋白表達量測定結(jié)果表明（表1），Bt蛋白在葉片中的表達有時空差異性。5月下旬至7月中旬，棉花不同時期葉片的Bt蛋白表達量依次為：盛花期＞子葉期＞七葉期＞三葉期。在七月中旬，盛花期的葉片Bt蛋白高達303.6 ng／g鮮重。在對照棉中，在棉花的各時期的葉片中均未檢測到Bt蛋白。

表1 Bt棉不同時期葉片Bt毒蛋白的表達量 ng／gTab.1 Bt toxin content in different stages＇leaf of transgenic Bt cotton plants

2.2 Bt棉上棉蚜體內(nèi)Bt毒蛋白的含量測定

不同時期Bt棉田棉蚜體內(nèi)Gr yl Ab／Cr yl Ac蛋白含量的測定結(jié)果見圖1，圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤差。

由圖1可知：采自Bt棉上的棉蚜均可檢測到Bt蛋白的存在，除6月上旬采集到的棉蚜Bt含量（6.0 ng／g鮮 重）明顯較高外，6月中旬至8月初的4次測試結(jié)果沒有明顯差別，含量在2.8～3.7 ng／g鮮重之間。

6月上旬的Bt含量較高可能與棉蚜的生活習性、大田氣候、天敵數(shù)量少、棉葉Bt蛋白含量有關(guān)。到6月中下旬至8月的棉蚜體內(nèi)蛋白含量較低，棉蚜的形態(tài)較小，大田天敵數(shù)量增多，降雨量增多，這些都是制約棉蚜的取食因素。

圖1 不同時期Bt棉田的棉蚜體內(nèi)Cry1Ab／Cry1Ac蛋白含量值Fig.1 The content of Cry1Ab toxin protein in the body of Aphis.gossypii in Bt cotton plot in different stages注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤差。

2.3 Bt棉上的龜紋瓢蟲體內(nèi)蛋白的含量測定

通過對Bt棉田不同時期的龜紋瓢蟲體內(nèi)Bt蛋白含量檢測結(jié)果（表2）表明，龜紋瓢蟲的3～4齡幼蟲和成蟲體內(nèi)均可檢測到Bt蛋白。瓢蟲成蟲體內(nèi)Bt蛋白含量（16.9～27.8 ng／g鮮重）明顯高于幼蟲（8.4 ng／g鮮重），其幼蟲體內(nèi)Bt蛋白含量（8.4 ng／g鮮重）又明顯高于棉蚜（3.9 ng／g鮮重）。這說明Bt蛋白在棉蚜－龜紋瓢蟲之間具有傳遞效應(yīng)。瓢蟲成蟲體內(nèi)含量明顯高于幼蟲體內(nèi)含量，這主要歸因于瓢蟲的取食量，取食量越高，其體內(nèi)積聚的Bt蛋白含量越高。在常規(guī)棉上采集的昆蟲樣本均未檢測到Bt毒蛋白。

表2 棉田不同時間段的棉蚜和龜紋瓢蟲體內(nèi)Bt毒蛋白的含量 ng／gTab.2 Bt toxin content in Aphis gossypii and Propylaea japonica from different cotton developing stages

2.4 Bt棉對多代棉蚜和龜紋瓢蟲的生長發(fā)育影響

單頭棉蚜室內(nèi)連續(xù)養(yǎng)殖4代的觀察試驗結(jié)果表明，兩種棉花上的棉蚜的若蟲歷期大約5 d左右，但Bt棉上的棉蚜若蟲歷期比常規(guī)棉上的略短0.5 d左右，見表3，繁殖力略比常規(guī)棉高，存活力差異不大。由此可知，益農(nóng)二號対棉蚜各蟲態(tài)歷期均無顯著性影響。經(jīng)室內(nèi)繼代飼養(yǎng)試驗，也未見有何不利影響。龜紋瓢蟲的室內(nèi)養(yǎng)殖觀察表明，以兩種不同棉花上的棉蚜為食源的龜紋瓢蟲，見表4，益農(nóng)二號上的棉蚜為食的龜紋瓢蟲的存活力（87.3%）略比對照組（93.1%）低，說明Bt棉對龜紋瓢蟲的存活率有所影響，但生長發(fā)育若蟲歷期、繁殖力差異不大。從整個生命參數(shù)的觀測值來看，Bt棉Bt蛋白對龜紋瓢蟲并未產(chǎn)生不良影響。

表3 棉蚜的生長歷期統(tǒng)計表Tab.3 Statistics tables of Aphis.gossypii growth duration

表4 用不同棉田的棉蚜飼養(yǎng)時龜紋瓢蟲若蟲歷期、存活率和成蟲繁殖高峰期的繁殖力 25℃～31℃Tab.4 Develop mental duration and survival rate of immature Propylaea japonica and adult fecundity in their oviposition peak period feeding on the cotton aphis from different cotton plots

3 討論

Bt蛋白在取食昆蟲體內(nèi)的積累主要與食物中的Bt含量有關(guān)。棉花葉片中Bt的含量隨生長發(fā)育而有所增加［9］，相應(yīng)地，取食棉蚜體內(nèi)的Bt含量也在增長。我們在室內(nèi)培養(yǎng)的棉蚜Bt蛋白含量（5.5～7.9 ng／g）明顯高于大田棉蚜的（2.8～6.0 ng／g），其原因可能是我們在室內(nèi)培養(yǎng)棉蚜用的是子葉期的棉苗，棉蚜主要取食子葉，而大田棉蚜主要取食部位是嫩葉和嫩尖。如前文中所述，Bt在子葉中的表達要高于幼嫩的真葉。此外，取食時間和取食量也影響B(tài)t的積累［10］。

在棉花、棉蚜、龜紋瓢蟲體內(nèi)均可檢測到Bt蛋白，見表2。但龜紋瓢蟲成蟲體內(nèi)Bt蛋白含量比幼蟲高，雄蟲比雌蟲高，主要因為不同時期，不同性別的龜紋瓢蟲取食量的不同，其體內(nèi)Bt蛋白含量不同。在以往報道中，曾證實龜紋瓢蟲還可以在自然條件下直接取食獲取Bt毒蛋白［11－12］。說明Bt蛋白能夠在棉花－棉蚜－龜紋瓢蟲這一食物鏈中傳遞［5］。目前許多研究表明，Bt蛋白可以在多種轉(zhuǎn)基因植物的非靶標食物鏈中存在傳遞現(xiàn)象，如Cr yIA蛋白在轉(zhuǎn)基因棉花－抗性棉鈴蟲－中紅側(cè)溝繭繭峰食物鏈間的傳遞［13］。CryIAc蛋白在轉(zhuǎn)Bt基因水稻－稻縱卷葉螟－擬水狼蛛食物鏈中傳遞［14］，Cry1 Ab毒蛋白在轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻－褐飛虱－黑肩綠盲蝽、轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻－褐飛虱－稻虱纓小蜂等等食物鏈中都有所傳遞［15］，但以上的研究通過室內(nèi)昆蟲觀測實驗表明，Bt蛋白都未對非靶標生物產(chǎn)生不利影響。

雖然，Bt蛋白可以通過食物鏈轉(zhuǎn)移至棉蚜及龜紋瓢蟲體內(nèi)，但并未對棉蚜和龜紋瓢蟲的存活力，繁殖力及生長發(fā)育產(chǎn)生顯著的影響（表3，表4）。這與Bt蛋白殺蟲機理有關(guān)，Bt蛋白的靶標害蟲主要是鱗翅目，而對其他的同翅目，鞘翅目、半翅目等昆蟲無殺蟲活性。近幾年的棉蚜報道中，轉(zhuǎn)基因棉上的棉蚜種群增長指數(shù)明顯高于常規(guī)棉［16］，Bt棉上的棉蚜生命參數(shù)無顯著性變化，但蚜蟲生長歷期都比對照棉短［17］，這與本文室內(nèi)蚜蟲的生命參數(shù)的觀測結(jié)果相似。而劉向東研究結(jié)果相反，Bt棉上棉蚜內(nèi)稟增長率略比常規(guī)棉低。棉蚜的生長歷期縮短，繁殖力略高，這可能與棉花組織的Bt棉中的Bt蛋白能夠通過植食者移植棉蚜至龜紋瓢蟲體內(nèi)后對其是否會產(chǎn)生影響，一直是爭論的熱點。一些研究表明，Bt作物上的非靶標植食者對其天敵并未產(chǎn)生不利影響。如取食轉(zhuǎn)Bt基因棉上棉蚜的中華草蛉（Chr ysoperl a sinica）及麗草蛉（Chr ysopa f or mosa Br auer），其生長和繁殖未見顯著不利影響［18］，Bt玉米飼喂的歐洲玉米螟（Ostrina nubil alis）低齡幼蟲不影響小花蝽（Orius insidiosus）若蟲的存活和發(fā)育［19］。轉(zhuǎn)Bt基因馬鈴薯上的桃蚜（Myzus persicae）對集棲瓢蟲（Hip podamia conver gens）存活、捕食、發(fā)育和繁殖沒有影響［19］。但也有一些研究表明，Bt作物中的Bt毒素通過植食性害蟲可對捕食性天敵產(chǎn)生不利影響，如Bt玉米飼喂的歐洲玉米螟和海灰翅夜蛾（Spodopter a littor alis）顯著增高普通草蛉死亡率［20］，并延長其發(fā)育歷期；另外，還有一些其他轉(zhuǎn)基因作物對一些瓢蟲產(chǎn)生不利的影響報道。Birch等［21］研究表明，轉(zhuǎn)GNA（雪蓮凝集素）基因馬鈴薯上的桃蚜降低了二星瓢蟲（Adaliabi punctata）的產(chǎn)卵量、卵孵化率和壽命，所以說不同轉(zhuǎn)基因作物的Bt蛋白通過植食性昆蟲到其天敵影響各有不同。

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Transferred of Bt Protein in Non-target Organism-Aphis Food Chain

WANG Haiyan，SU Jianhui，WANG Zihua，ZHAN Jiepeng，XIANG Benchun，HUANG Xianzhong，ZHENG Yinying
（College of Life Science／Key Laboratory of Agricultrure Biotechnology of Shihezi University，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

The expression of Cry1 Ac or Cry1Ab toxin in different leaves＇stages of transgenic Bt cotton（AgroSciences II）and Conventional cotton were detected by EILSA assay.The Bt toxic protein content in the body of Aphids and P.Japonica was measured.We observed the life parameters changement of the relative insects which was fed on different food source via the Indoor feeding experi ment.The results demonstrate that the toxic protein Cr y1Ac／Cr y1Ab＇s quantitative expression in Bt cotton＇s leaves increased with the Bt cotton growth：from the three leaf stage（121 ng／g）increased to bloom stage（304 ng／g），but the cotyledon leaf were higher t han other organs.Accor dingly，t he Bt toxin in the body of Aphids and P.Japonica could be detected in the pest-resistant cotton.The highest Bt protein content of the Aphids is 6 ng／g，the average content is 2.8～3.7 ng／g.The contentration of the Aphids when it is at the f ourth instar larvae and female and male adult P.j aponica is 8.4，16.9，27.8 ng／g respectivly on aging in Bt cotton.The effective trans mission of the Bt toxic protein is significant.In addition，indoor insect feeding test indicated that the Aphids＇ny mphal period on Bt cotton was shorter 0.5 d，the Reproduction and Molting rate was slightly higher compared with conventional cotton.However，when P.Japonica was fed on cotton aphis which collected fro m the transgenic Bt cotton plots，we found that the Ladybir ds＇develop ment and survival from hatching to emerge as well as the Reproductive ability was not significantly different fro m those of the Control.

pest-resistant cotton；Bt toxin；Aphis.gossypii；Propyl aea.j aponica；Enzy me-linked i mmunosor bent assay

R944.4

A

1007-7383（2011）04-0420-05

2011-04-29

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項（2008ZX08012-04）

王海燕（1983-）女，碩士生，專業(yè)方向為植物基因工程研究。

鄭銀英（1975-），女，副教授，從事植物病毒學(xué)研究；e-mail：zyycbm＠sina.cn。