王蕾，岳英，魯曉燕，馬兵鋼

不同色澤番茄品種類胡蘿卜素含量的HPLC分析

王蕾，岳英，魯曉燕，馬兵鋼

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系，石河子832003）

以成熟果為紅色、紫紅色、棗紅色、棕色、黃色、青綠色的6個番茄品種為試材，采用高效液相色譜外標(biāo)法對果實成熟過程中綠熟期、發(fā)白期、顯色期、轉(zhuǎn)色期、紅熟期的番茄紅素、葉黃素、β－胡蘿卜素含量進行測定。結(jié)果表明：在番茄果實成熟過程中，不同番茄果實番茄紅素、葉黃素、β－胡蘿卜素含量不同。紅果番茄番茄紅素含量最高，綠果、黃果番茄基本不含番茄紅素。而綠果、黃果番茄的葉黃素、β－胡蘿卜素明顯高于其它顏色的番茄。番茄紅素在綠熟期、發(fā)白期基本上沒有形成，轉(zhuǎn)色期是番茄紅素形成的一個過渡期，在成熟期含量達到了最高。葉黃素、β－胡蘿卜素含量在綠熟期都有少量生成，發(fā)白期略微下降，轉(zhuǎn)色期開始上升，成熟期含量達到最高。

番茄果實；胡蘿卜素；番茄紅素；葉黃素；β－胡蘿卜；高效液相色譜

類胡蘿卜素大量存在于許多黃色、橙色和紅色果實及花器官中。其含量和組成決定果實外觀品種和花卉的觀賞價值［1］，而且在猝滅自由基［2］、防癌抗癌［3］、增強人體免疫力［4］、保護心血管疾病和抗老化［5］等保護人類健康方面起著重要的作用。植物類胡蘿卜包括葉黃素（胡蘿卜的氧化衍生物）和胡蘿卜素（碳氫化合物）兩大類。研究表明，類胡蘿卜素的積累使植物的果實（如番茄［6］）、根（如胡蘿卜［7］）、花（萬壽菊［8］）和葉呈現(xiàn)多彩的顏色，使之具有較大的經(jīng)濟價值。番茄是世界范圍普遍栽培的重要蔬菜作物，其營養(yǎng)豐富，味道鮮美，深受人們的喜愛。番茄果實中的類胡蘿卜素主要包括番茄紅素、葉黃素和胡蘿卜素。由于其所含類胡蘿卜素種類少，在成熟階段色澤變化明顯，且擁有大量不同果實顏色的突變體，因而成為研究植物類胡蘿卜素代謝途徑的模式植物［9］。國外對番茄類胡蘿卜素尤其是番茄紅素的研究較早。Fraser等［10］研究表明，在番茄果實成熟過程中，葉綠體轉(zhuǎn)化為有色體，類胡蘿卜素上升10～14倍，這主要是番茄紅素含量增加了500多倍的結(jié)果。Ronen等［11］和Pecker等［12］檢測工番茄果實發(fā)育過程中相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化，得出番茄果實中類胡蘿卜素的積累主要是相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平上差異表達的結(jié)果。曲瑞芳等［13］對番茄和櫻桃番茄果實發(fā)育成熟過程中的番茄紅素含量變化進行了研究，指出番茄紅素含量隨果實發(fā)育逐漸增加。

雖然國內(nèi)外關(guān)于番茄果實類胡蘿卜素組份及含量分析有不少報道，但有關(guān)各個色澤的番茄果實在成熟發(fā)育過程中類胡蘿卜素組份和含量變化的報道甚少，而且測定方法主要是紫外分光光度法。本研究以高效液相色譜的方法測定番茄果實成熟過程中的番茄紅素、β－胡蘿卜素和葉黃素含量，分析其果實成熟發(fā)育過程中類胡蘿卜素組分和含量的變化，旨在了解番茄果實成熟過程中類胡卜素的變化特點，研究番茄果實成熟過程中類胡蘿卜素代謝規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的6個不同色澤的番茄品種分別購自北京金土地農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所、北京綠東方農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所。根據(jù)果實成熟后顏色分成6種類型。Ⅰ類：圣女雜交一代（成熟果為紅色）；Ⅱ類：紫水晶F1（成熟果為棗紅色）；Ⅲ類：鬼臉歡歡（紫紅色）；Ⅳ類：棕圣果（成熟果為棕色）；Ⅴ類：彩臉金金（成熟果為黃色）；Ⅵ類：綠臉迎迎（成熟果為青綠色）。供試材料于2010年4月播種，5月17定植于石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗站大田中。管理和大田栽培相同。

番茄紅素、葉黃素、β－胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司 （Sigma-Aldrich，L9879、C9750、X6250），純 度 ＞95%；石油醚、甲醇、甲苯（天津化學(xué)分析純試劑）；甲醇、乙腈、二氯甲烷、異丙醇購自 Honeywell Burdick＆Jackson公司；水為蒸餾水經(jīng)純水裝置（Heal-Force）進行去離子處理，比阻抗達18兆歐以上。

1.2 方法

1.2.1 材料的選擇

取樣分5個時期：1）綠熟期。綠色，堅實，不宜食用；2）發(fā)白期。外觀開始由綠色變白；3）顯色期。果實頂端轉(zhuǎn)色達全果的10%；4）轉(zhuǎn)色期。果實轉(zhuǎn)色達全果的30%～60%；5）紅熟期。果實呈現(xiàn)品種的特有色澤，適于生食。各成熟時期均選取10個果實并對不同部位進行采樣，3次重復(fù)，7月下旬進入綠熟期開始測定各色番茄在果實成熟過程中的番茄紅素、β－胡蘿卜素和葉黃素的含量。

1.2.2 番茄類胡蘿卜素的提取

取采集100～150 g的果實切成小塊放入搗碎機中搗碎，收集果實勻漿。番茄紅素提取采用李敏［14］的方法并略作改動。稱取勻漿的果實0.5 g，加入少量的石英砂，5 mL的甲醇，放入洗凈的研缽，研磨充分后過濾，剩余的殘渣再加入甲醇，重復(fù)加入甲醇，直至濾液無色，棄去濾液，用甲苯分?jǐn)?shù)次提取番茄紅素，直至濾液無色為止。濾液移入棕色容量瓶中，用甲苯定容。葉黃素、β－胡蘿卜素的提取采用劉國道等［15］的超生波輔取法提取葉黃素、β－胡蘿卜素。取勻漿的果實0.5 g，15 mL石油醚，35℃下超聲波萃取30 min，過濾。將提取液經(jīng)濾膜過濾后，外標(biāo)法進行HPLC分析，全部操作在避光下進行。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別準(zhǔn)確稱取2 mg番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品、葉黃素、β－胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，用少量三氯甲烷溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中，番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品用甲苯定容至100 mL，葉黃素、β－胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品用石油醚定容至100 mL，配制成200μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)液。番茄紅素用甲苯，葉黃素、β－胡蘿卜素用石油醚分別等比稀釋為以下6個濃度：200、100、75、50、25、10μg／mL，濾膜過濾后，進行HPLC分析。每濃度重復(fù)進樣3次，記錄各標(biāo)樣的峰面積、保留時間，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.4 類胡蘿卜素的HPLC分析

分別取2 mL定容后的標(biāo)樣液或樣品液于液相色譜樣品瓶中，按順充放入自動進樣器內(nèi)。高效液相色譜儀（美國Aglient公司）包括四元梯度泵、V WD檢測器、標(biāo)準(zhǔn)型自動進樣器。色譜柱柱型：反相C18（150 mm×4.6 mm）5μm（澳大利亞SGE公司）。進樣法：自動進樣器，10μL；

葉黃素、β－胡蘿卜素檢測條件：1）流動相。乙腈∶二氯甲烷∶異丙醇8∶1∶1；2）柱溫。30℃；3）流速。1 mL／min；4）檢測器。V WD，450 n m。

番茄紅素檢測條件：1）流動相。甲醇∶乙腈∶二氯甲烷二7∶7∶2；2）柱溫：30℃；3）流速：1 mL／min；4）檢測器：VWD、472 nm。參照馬超等［16］的方法并略有改進，采用外標(biāo)法測定各類胡蘿卜素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄類胡蘿卜素的測定結(jié)果

被分離物質(zhì)在高效液相色譜上依據(jù)保留時間定性。番茄紅素標(biāo)樣在本實驗中保留時間為12.211～12.913 min，葉黃素為2.817～2.853 min，β－胡蘿卜素為17.319～18.017 min。圖1為6個不同色澤的番茄在紅熟期時的番茄紅素HPLC色譜圖，其中Ⅴ、Ⅵ的色譜圖，峰面積相比另4種非常小，可以看出黃果和綠果的番茄番茄紅素含量低。圖2為6個不同色澤番茄在紅熟期時的β－胡蘿卜素、葉黃素的HPLC色譜圖。

圖1 不同色澤番茄紅熟期時番茄紅素樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of lycopene sample in tomato fruit at ful-ripe stage

圖2 不同色澤番茄紅熟期時葉黃素、β－胡蘿卜素樣品色譜圖Fig.2 Chromatograms of Lutein andβ-Carotene sample in tomato at the full-ripe stage

2.2 果實成熟過程中主要色素含量的變化動態(tài)分析

2.2.1 果實成熟過程中番茄紅素含量的動態(tài)變化

由表1可知，6個不同顏色番茄在成熟過程中的番茄紅素變化規(guī)律相似。隨著果實的成熟，從發(fā)白期到轉(zhuǎn)色期，番茄紅素均略有增加，但隨著番茄的成熟，從轉(zhuǎn)色期到紅熟期，番茄紅素含量均迅速上升，達到成熟過程中的最大值。各品種由綠熟期向轉(zhuǎn)色期的發(fā)育過程中番茄紅素含量變化不顯著，這說明綠熟期向轉(zhuǎn)色期的發(fā)育過程中番茄紅素合成很少，增長緩慢。這一時期果實色素仍以葉綠素和其他類胡蘿卜素為主。

紅熟期與綠熟期、發(fā)白期、顯色期、轉(zhuǎn)色期差異顯著（P＜0.05），與綠熟期、發(fā)白期、顯色期差異極顯著（P＜0.01），與轉(zhuǎn)色期未達到極顯著水平。這說明轉(zhuǎn)色期是番茄紅素的一個過渡期，番茄紅素在紅熟期成為主要色素。

整個果實成熟過程中，綠臉迎迎、彩臉金金變化不大，番茄紅素含量均低于其它幾個品種。其中，圣女雜交一代變化量最大，紅熟期番茄紅素含量為轉(zhuǎn)色期的6.529倍，棕圣果4.958倍，鬼臉歡歡1.998倍，綠臉迎迎1.233倍，彩臉金金1.1733。成熟期番茄紅素含量依次為圣女雜交一代＞棕圣果＞鬼臉歡歡＞紫水晶F1＞彩臉金金＞綠臉迎迎。從外觀上看，含量較低的綠臉迎迎、彩臉金金成熟之后為青綠色、黃色，而含量最高的2個品種圣女雜交一代，成熟之后均為紅色。這說明，果實番茄紅素含量與果實顏色有關(guān)系，果實越紅，番茄紅素含量越高，而綠果、黃果番茄基本上不含有番茄紅素。

表1 不同發(fā)育時期番茄果實中番茄紅素含量變化Tab.1 Changes of Lycopene content in tomato fruits at different stages

2.2.2 果實成熟過程中β－胡蘿卜素含量的動態(tài)變化

由表2可以看出，β－胡蘿卜素在綠熟期即有少量生成，進入發(fā)白期，含量略有下降，隨著果實的成熟，β－胡蘿卜素含量又有所回升，在成熟期含量達到最高。綠熟期向顯色期的發(fā)育過程中β－胡蘿卜素含量變化不顯著；紅熟期的含量與綠熟期、發(fā)白期、顯色期的差異極顯著（P＜0.01），與轉(zhuǎn)色期差異顯著（P＜0.05）。這說明在綠熟期向轉(zhuǎn)色期的發(fā)育過程中β－胡蘿卜素合成很少，而轉(zhuǎn)色期也是β－胡蘿卜素合成的一個過渡期。

6種色澤的番茄果中，黃果番茄彩臉金金β－胡蘿卜素含量均比其它顏色的番茄含量高。成熟期β－胡蘿卜素含量依次為彩臉金金＞綠臉迎迎＞紫水晶F1＞棕圣果 ＞圣女雜交一代＞鬼臉歡歡。彩臉金金的β－胡蘿卜素分別為綠綠迎迎的1.23倍，紫水晶F1的1.79倍，棕圣果的2.03倍，圣女雜交一代的2.19倍，鬼臉歡歡的2.65倍。

表2 不同發(fā)育時期番茄果實中β－胡蘿卜素含量變化Tab.2 Changes ofβ-carotene content in tomato fruits at different stages

2.2.3 果實成熟過程中葉黃素含量的動態(tài)變化

由表3可知，葉黃素在果實的整個發(fā)育過程中進入發(fā)白期，含量也是略有下降，顯色期含量持續(xù)下降，轉(zhuǎn)色期開始上升，在成熟期含量也是達到了最高。葉黃素含量在紅熟期達到最大值0.146 mg／100 g F W。5個時期的葉黃素含量有明顯的顯著性，在葉黃素含量的低點和最高點達到了顯著水平，而轉(zhuǎn)色期為葉黃素含量增加的轉(zhuǎn)折點，與其他時期均不顯著（P＜0.05）。各個時期均表現(xiàn)為極不顯著（P＜0.01）。這說明轉(zhuǎn)色期向紅熟期的發(fā)育階段是葉黃素合成的關(guān)鍵時期。

從最終的含量來看，黃果彩臉金金的葉黃素含量明顯高于其它5種色澤的番茄，而這5種色澤的番茄葉黃素含量間差異不大。

表3 不同發(fā)育時期番茄果實中葉黃素含量變化Tab.3 Changes of Xanthin content in tomato fruits at different stages

2.2.4 類胡蘿卜素總量成熟過程中的動態(tài)變化

果實在剛開始的綠熟期、發(fā)白期，類胡蘿卜素總量均無變化，各個品種間含量差別也不大。進入顯色期，各個品種的類胡蘿卜素總量一直處于上升趨勢，在紅熟期達到高峰，品種間的差別也加大。類胡蘿卜素總量最大的為圣女雜交一代，其類胡蘿卜素總量為彩臉金金、綠臉迎迎類胡蘿卜素總量的20倍以上（圖3）。其變化趨勢和番茄紅素的基本一致，由此可見，番茄紅素是番茄果實中的主要類胡蘿卜素。

圖3 不同番茄在果實成熟過程中類胡蘿卜素總量的變化Fig.3 Changes of total carotenoid content in different tomato during ripening

3 討論

番茄番茄紅素含量的檢測時所得檢測值往往大于真實值。其原因是番茄及其制品中除番茄紅素外還含有其它類胡蘿卜素，如β－胡蘿卜素。這些類胡蘿卜素在檢測波長下有一定的光吸收，這導(dǎo)致檢測值偏高，影響測定結(jié)果。因此，本實驗在測定番茄紅素時，首先將番茄及萃取物中番茄紅素與其它類胡蘿卜素分離，排除其干擾，再用HPLC對番茄紅素含量進行檢測。

許多植物花和果的顏色與其積累的葉綠素、類胡蘿卜素、花青苷、類黃酮種類及含量有關(guān)。戴雄澤等［17］研究了不同顏色辣椒果實發(fā)育過程中類胡蘿卜素種類和含量的變化規(guī)律，不同顏色辣椒果實中類胡蘿卜素合成途徑不同。青果期為綠色、成熟期為紅色的品種為選育高辣椒紅素的理想材料。熊作明等［18］研究了不同類型枇杷著色期間類胡蘿卜素含量的變化，指出胡蘿卜素積累，尤其是β－胡蘿卜素含量的高低是影響枇杷果肉色澤深淺的主要原因。

番茄因其在成熟階段色澤變化明顯，所含類胡蘿卜素種類較少，因而已經(jīng)成為研究植物類胡蘿卜素發(fā)育的模式植物。本實驗測定不同顏色（紅色、紫紅色、棗紅色、棕色、黃色、青綠色）番茄果實發(fā)育過程中番茄紅素、葉黃素、β－胡蘿卜素含量，發(fā)現(xiàn)紅果番茄番茄紅素含量最高，綠果、黃果番茄基本不含番茄紅素。曾有報道［10，13］也得出與本實驗一致的結(jié)論：番茄的番茄紅素含量與果實顏色有關(guān)，果實越紅，番茄紅素含量越高。而綠果、黃果番茄的葉黃素、β－胡蘿卜素明顯高于其它其它顏色的番茄。從番茄果實發(fā)育的各個過程來看，番茄紅素在綠熟期、發(fā)白期基本未形成，轉(zhuǎn)色期是番茄紅素形成的一個過渡期，在成熟期含量達到了最高。葉黃素、β－胡蘿卜素在綠熟期均有少量生成，發(fā)白期略微下降，轉(zhuǎn)色期開始上升，成熟期含量達到最高。

番茄果實成熟過程中，番茄紅素的積累受果實發(fā)育過程中一系列類胡蘿卜合成基因的表達水平調(diào)控［19］。李京等［20］的研究結(jié)果表明，在果實成熟過程中，控制八氫番茄紅素脫氫酶的基因Pds和控制八氫番茄紅素合成酶的基因Psy-1非常活躍，其mRNA水平顯著增加。而番茄紅素向下游產(chǎn)物α－胡蘿卜素、β－胡蘿卜素的番茄紅素環(huán)化酶基因Lcy－β和Lcy－ε的mRNA水平下降，并逐漸消失。這些變化表明，不同番茄果實中番茄紅素、葉黃素、β－胡蘿卜素的積累與果實發(fā)育過程中類胡蘿卜素合成酶相關(guān)基因的表達調(diào)控有很大關(guān)系，但調(diào)控機制尚不明確，仍需進一步研究。

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Carotenoid Contents in Different Coloured Tomato Varieties By HPLC

WANG Lei，YUE Ying，LU Xiaoyan，MA Binggang
（Agricultural College，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

With red，pur ple，pur plish red，br own，yellow，green to matos as test material，the dynamic changes of lycopene，β-car otene and xanthin contents during the fruit ripening course were deter mined by HPLC external standard method.The results show that the lycopene，β-carotene and xanthin content were different in different types during the develop ment of to mato fr uit.Lycopene contents in red color fruit was highest among the other five tested varieties，while the content of yellow color fruit was significantly lower than ot hers.β-carotene and xanthin contents in yellow and green color fr uit was higher t han t he other color fruit.In the ripening develop ment of tomato fruit，the lycopene content was increased gradually.The develop ment period from half-ripe to f ull-ripe is the key stage for lycopene synt hesis.Theβ-carotene and xanthin contents were decreased firstly and then increased，and the three car otenoids content achieved t he highest when the co mpletely ripe fr uit.

tomato；carotenid；lycopene；xanthin；β-carotene；HPLC

S641.2

A

1007-7383（2011）04-0442-06

2011-01-03

國家自然科學(xué)基金項目（30460081），新疆兵團博士資金項目（ZD2007JC06）

王蕾（1986-），女，碩士生，研究方向為園藝植物分子育種；e-mail：wangleiguoshu008＠sina.co m。通訊作者：馬兵鋼（1972-），男，教授，博士，從事園藝植物分子育種研究；e-mail：binggang＠hot mail.com。