姬云濤，王亦舒，李星辰，屈長(zhǎng)青

(1.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 阜陽(yáng) 236041;2.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂滴的油紅O染色觀察

姬云濤1，王亦舒2，李星辰1，屈長(zhǎng)青1

(1.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 阜陽(yáng) 236041;2.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

目的 通過(guò)油紅O染色對(duì)秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)腸道脂類物質(zhì)沉積的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行觀察。方法 在NGM培養(yǎng)基中加入油紅O染液，對(duì)正常生理狀態(tài)中的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的脂滴進(jìn)行染色。結(jié)果72 h后發(fā)現(xiàn)線蟲的腸道普遍被染成紅色。結(jié)論 油紅O染液可以對(duì)活體線蟲的脂滴進(jìn)行染色，為后續(xù)研究線蟲脂肪沉積的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

秀麗隱桿線蟲;油紅O;脂滴;染色

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)屬于線蟲動(dòng)物門、線蟲綱動(dòng)物，是研究發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和老年衰老學(xué)的理想模型生物［1］。兩性成蟲只有959個(gè)體細(xì)胞，雄性成蟲只有1 031個(gè)體細(xì)胞。其腸道是由咽和腸兩部分組成，是脂類物質(zhì)沉積的主要場(chǎng)所，由于線蟲蟲體透明，所以在顯微鏡下可以很清楚地看到從頭部到尾部的整個(gè)腸道。

脂肪是重要的生命物質(zhì)，但脂肪過(guò)多對(duì)動(dòng)物也會(huì)帶來(lái)很大的危害。所以對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的脂肪組織進(jìn)行分析研究具有極為重要的意義。油紅O為脂溶性染料，在脂肪內(nèi)能高度溶解，進(jìn)而著色，能較好的顯示組織中的脂肪滴［2］。本文以油紅O為染色試劑，對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的脂肪組織進(jìn)行染色，為后續(xù)研究線蟲脂肪沉積的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

N2野生型秀麗隱桿線蟲，由中科院等離子體物理研究所吳李君研究員惠贈(zèng);大腸桿菌OP50作為秀麗隱桿線蟲的食物。種子培養(yǎng)基、NGM培養(yǎng)基和各種緩沖液的配制參照文獻(xiàn)［3］。

油紅O染液:取油紅0.1 g，加磷酸三乙酯至100 mL，放入60℃水浴中加溫溶解30 min，配成油紅O儲(chǔ)備液。取油紅O儲(chǔ)備液與飽和β-環(huán)糊精溶液1∶1混合配制成工作液，用微孔濾器過(guò)濾除菌后備用。

2 方法

2.1 大腸桿菌(E.coil)的培養(yǎng)

從冰箱中取出靜置保存的大腸桿菌懸液，振蕩，接種于盛有種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，放入37℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。

2.2 蟲體的培養(yǎng)

線蟲于16℃下采用標(biāo)準(zhǔn)程序培養(yǎng)于NGM瓊脂糖培養(yǎng)皿［3］中。

2.3 蟲體的染色

用冰M9緩沖液將蟲體洗下，置于4℃，20 min，棄上清，沉淀物用M9緩沖液重懸后置于4℃，20 min，棄上清。取沉淀物 200μL與油紅 O染液600μL混合后，接種于涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基中，置于16℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，取1%鹽酸四咪唑溶液10μL滴于NGM平板的蟲體上，約5 min蟲體麻醉后，用M9緩沖液將蟲體洗下，置于載玻片上，觀察，拍照。

3 結(jié)果

72 h后，將麻醉后蟲體置于顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)線蟲的腸道普遍被染成紅色(圖1A)，而沒(méi)有染色的對(duì)照組線蟲則為透明的(圖1B)。

4 討論

秀麗隱桿線蟲是一種較為理想的模式生物，身體透明，利用其作為生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)象有著非常明顯的優(yōu)勢(shì)。腸道是線蟲一個(gè)比較典型的器官，也是其脂肪沉積的主要場(chǎng)所，由均勻?qū)ΨQ、排列在管腔內(nèi)表面的20個(gè)大上皮細(xì)胞構(gòu)成，每對(duì)細(xì)胞都可以形成一個(gè)腸環(huán)。Kimura等［4］用蘇丹黑染色觀察到其體內(nèi)的脂滴(呈黑色)，Ashrafi等［5］用熒光染料尼羅紅和BIDIPY也獲得較好的脂滴圖像，但目前尚未見用油紅O對(duì)線蟲脂肪染色觀察的報(bào)道。油紅O屬于偶氮染料，難溶于水，是一種很強(qiáng)的脂溶劑和染脂劑，與甘油三酯結(jié)合呈紅色小脂滴狀，在研究脂肪細(xì)胞增殖與分化中具有非常直觀的優(yōu)勢(shì)［6］。因其難溶于水，所以在染色過(guò)程中易形成結(jié)晶，經(jīng)過(guò)摸索與實(shí)踐，我們把油紅O與β-環(huán)糊精溶液混合，經(jīng)β-環(huán)糊精包合后，染色，獲得理想的效果，證明線蟲體內(nèi)的脂滴亦可用油紅O染色，本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)研究線蟲脂肪沉積的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

圖1 秀麗隱桿線蟲油紅O染色圖(×100)Fig.1 Morphology of C.elegans( ×100)

［1］Brenner S.The genetics of Caenorhabditis elegans［J］.Genetics，1974，77:71-94.

［2］屈長(zhǎng)青，張國(guó)華，陳粉粉，等.豬前體脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng)［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，13(5):649-653.

［3］龐林海，杜愛(ài)芳，李孝軍，等.秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)特性與保存方法研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，19(1):34-36.

［4］Kimura K D，Tissenbaum H A，Liu Y，et al.daf-2，an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans［J］.Science，1997，277:942-946.

［5］Ashrafi K，Chang F Y，Watts JL，et al.Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes［J］.Nature，2003，421:268-272.

［6］屈長(zhǎng)青，李東偉，朱茂英.一種改進(jìn)的培養(yǎng)脂肪細(xì)胞染色法［J］.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2008，13(3):329-330.

Visualization of fat droplets of Caenorhabditis elegans

JI Yun-tao1，WANG Yi-shu2，LI Xing-chen1，QU Chang-qing1
(1.Engineering Technology Research Center of Anti-aging Chinese Herbal Medicine，F(xiàn)uyang 236041，China;2.School of Life Science，Anhui Normal University，Wuhu 241000，China)

R965.1

A

1005-1678(2011)02-0141-02

2010-03-12

安徽省高校省級(jí)優(yōu)秀青年人才基金資助項(xiàng)目(No.2010SQRL142)

姬云濤，女，博士，副教授;屈長(zhǎng)青，通信作者。