劉青芝，李 霞，蘇移山，朱希強(qiáng)，郭學(xué)平，

(1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東省生物藥物研究院，山東 濟(jì)南 250101)

響應(yīng)面法優(yōu)化γ-聚谷氨酸發(fā)酵條件

劉青芝1，李 霞2，蘇移山2，朱希強(qiáng)2，郭學(xué)平1，2

(1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東省生物藥物研究院，山東 濟(jì)南 250101)

目的 優(yōu)化菌株Bacillus subtilis S18產(chǎn)γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的發(fā)酵條件，提高發(fā)酵水平。方法 用Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì)對(duì)影響γ-PGA發(fā)酵的8個(gè)因素進(jìn)行效應(yīng)評(píng)價(jià)，最陡爬坡法選取逼近最佳響應(yīng)面區(qū)域的發(fā)酵條件，通過中心組合實(shí)驗(yàn)法及響應(yīng)面分析，確定最優(yōu)發(fā)酵條件，并驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀＝Y(jié)果 PB設(shè)計(jì)篩選出3個(gè)對(duì)γ-PGA發(fā)酵有顯著影響的因素:谷氨酸鈉、酵母粉和MgSO4，用最陡爬坡法確定中心水平后，中心組合實(shí)驗(yàn)法分析出其最佳濃度分別為谷氨酸鈉76.92 g/L、酵母粉27.20 g/L、MgSO40.26 g/L，優(yōu)化后 γ-PGA 水平提高到 56.9 g/L。結(jié)論 在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，γ-PGA的水平比優(yōu)化前提高了93.5%。

γ-聚谷氨酸;發(fā)酵;Plackett-Burman設(shè)計(jì);響應(yīng)面分析;Bacillus subtilis S18

γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-PGA)是由谷氨酸通過γ-酰胺鍵結(jié)合形成的聚氨基酸。γ-PGA溶于水，可食用，可降解，對(duì)人體和環(huán)境無毒性，是一種很有潛力的陰離子聚合物，在醫(yī)藥、食品、化妝品、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用前景［1-3］。γ-PGA于1937年在細(xì)菌莢膜中被發(fā)現(xiàn)，自然界中可以由芽孢桿屬細(xì)菌合成，生產(chǎn)菌株主要有枯草芽孢桿菌［4-5］、地衣芽孢桿菌［1］、炭疽芽孢桿菌［6］等。

目前，日本等國家已經(jīng)采用發(fā)酵法實(shí)現(xiàn)γ-PGA的工業(yè)化生產(chǎn)，發(fā)酵水平在25～50 g/L之間［7］。由于γ-PGA發(fā)酵液黏度較高，嚴(yán)重影響發(fā)酵液的溶氧水平，進(jìn)而影響菌株的生長及γ-PGA水平的進(jìn)一步提高，因此，如何提高菌株的攝氧能力是目前亟待解決的主要問題。

透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，VHb)是一種原核生物的血紅蛋白，它能夠從分子水平上提高菌體自身對(duì)溶氧的利用能力，使之適應(yīng)較低的溶氧水平，從而促進(jìn)菌體的生長和一些代謝產(chǎn)物的合成［8］。本實(shí)驗(yàn)室從豆制品中篩選1株能夠生產(chǎn)γ-PGA的菌株Bacillus subtilis 18-3，然后將VHb的基因整合到該菌株的基因組中，得到能夠表達(dá)VHb的菌株Bacillus subtilis S18，提高了該菌株的攝氧能力。本研究采用響應(yīng)面法對(duì)工程菌株Bacillus subtilis S18產(chǎn)γ-PGA的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期進(jìn)一步提高發(fā)酵水平。

1 材料

Bacillus Subtilis S18菌株，山東省生物藥物研究院保藏。γ-PGA對(duì)照品(含量≥99%，HPLC面積歸一法測(cè)定)，山東省生物藥物研究院提供;其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

固體培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L，酵母粉5 g/L，谷氨酸鈉5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，瓊脂20 g/L。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，酵母粉5 g/L，谷氨酸鈉 10 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖50 g/L，酵母粉20 g/L，谷氨酸鈉 60 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.5。

HZQ-Q型恒溫培養(yǎng)箱，中國哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;Waters 600E型高效液相色譜儀，美國Waters公司。

2 方法

2.1 培養(yǎng)條件

挑取斜面培養(yǎng)的Bacillus subtilis S18至裝有一級(jí)種子培養(yǎng)基25 mL的100 mL錐形瓶中，37℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)8 h。從一級(jí)種子培養(yǎng)基中取2.5 mL接入到裝有二級(jí)種子培養(yǎng)基50 mL的250 mL錐形瓶中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，再從二級(jí)種子培養(yǎng)基中取2.5 mL接入到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL的250 mL錐形瓶中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

2.2 發(fā)酵液中γ-PGA濃度測(cè)定

2.2.1 色譜條件 用凝膠色譜法測(cè)定γ-PGA濃度。色譜柱:Waters Ulttrahydrogel 1000色譜柱(7.8 mm×300 mm);柱溫:35℃;檢測(cè)波長:220 nm;流動(dòng)相:10 mmol/L Na2HPO4和15 mmol/L KH2PO4混合緩沖液;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。

2.2.2 樣品測(cè)定 取發(fā)酵液2 mL，加水稀釋50倍，12 000 r/min離心10 min，取上清液分析。用外標(biāo)法以峰面積定量，γ-PGA對(duì)照品的濃度為1 g/L。

2.3 培養(yǎng)基的優(yōu)化設(shè)計(jì)

2.3.1 Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì) 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用n=12的PB設(shè)計(jì)，選取發(fā)酵條件的8個(gè)主要影響因素(A:谷氨酸鈉的濃度，B:酵母粉的濃度，C:蔗糖的濃度，D:K2HPO4的濃度，E:MgSO4的濃度，F(xiàn):NaCl的濃度，G:培養(yǎng)液的初始pH，H:接種量)進(jìn)行考察，每個(gè)因素分別取高低2個(gè)水平(－1，1)，并余 3 個(gè)空項(xiàng)(J，K，L)作誤差分析，用Design expert 7.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(見表1)，根據(jù)所得結(jié)果分析各因素對(duì)γ-PGA水平的效應(yīng)，并進(jìn)行顯著性(P＜0.05)評(píng)價(jià)，從而獲得對(duì)γ-PGA水平有顯著影響的因素。

2.3.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 由于響應(yīng)面擬合方程旨在反映緊接最大值的鄰域的近似真實(shí)情形，因此，利用最陡爬坡法盡可能逼近最大產(chǎn)γ-PGA區(qū)域后，才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程。最陡爬坡法的爬坡方向和變化步長由PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的各變量系數(shù)決定，如果系數(shù)為負(fù)，則該因素水平應(yīng)為遞減，反之遞增，找出峰值，從而快速的接近最大響應(yīng)區(qū)域。

2.3.3 中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析 根據(jù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到二次方程，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最后在一定的水平范圍內(nèi)求出最佳值，即最大產(chǎn)γ-PGA量對(duì)應(yīng)的發(fā)酵條件。3 結(jié)果與討論

3.1 PB設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

PB設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。從各變量的系數(shù)可看出谷氨酸鈉濃度、酵母粉濃度、蔗糖濃度及接種量對(duì)γ-PGA水平顯示正效應(yīng)，K2HPO4、MgSO4、NaCl的濃度和培養(yǎng)液的初始pH均顯示負(fù)效應(yīng)。PB設(shè)計(jì)結(jié)果的方差分析表明酵母粉、谷氨酸鈉和MgSO4的濃度的效應(yīng)最大，且在置信區(qū)間95%之中，是影響γ-PGA水平的顯著因素。所以將酵母粉、谷氨酸鈉和MgSO4的濃度進(jìn)一步采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳發(fā)酵條件。

3.2 最陡爬坡法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，谷氨酸鈉和酵母粉濃度對(duì)γ-PGA水平有正效應(yīng)、MgSO4濃度有負(fù)效應(yīng)，要提高γ-PGA水平應(yīng)適當(dāng)提高培養(yǎng)基中谷氨酸鈉和酵母粉濃度，降低MgSO4濃度，其他因素影響不顯著，維持在中等水平。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)(見表3)選取谷氨酸鈉、酵母粉、MgSO4濃度的變化幅度依次為8，1.5，0.04 g/L，進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，選取逼近產(chǎn) γ-PGA的最大區(qū)域的組合。結(jié)果顯示3號(hào)實(shí)驗(yàn)條件下γ-PGA水平達(dá)到44.8 g/L，γ-PGA水平隨濃度變化均有下降，因此選取3號(hào)實(shí)驗(yàn)組合作為中心組合實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.1 The design and result of Plackett-Burman experiments

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Tab.2 The analysis of variance of Plackett-Burman experimental results

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.3 Design and results of the path of steepest ascent experiment

3.3 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)確定的因素，以及最陡爬坡實(shí)驗(yàn)得到的中心點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)用Design expert 7.0軟件中的中心組合設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)3因素(X1-谷氨酸鈉、X2-酵母粉、X3-MgSO4)的中心組合實(shí)驗(yàn)，以γ-PGA的水平為響應(yīng)值，取 5 種水平，以(－1.68，－1，0，1，1.68)編碼，選擇中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)為6，設(shè)計(jì)20組實(shí)驗(yàn)(見表4)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

由Design expert 7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表4)進(jìn)行回歸分析，擬合出一個(gè)二次方程:

表4 中心組合實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.4 The design and result of center composite experiments

對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5，模型在置信區(qū)間99%之中，置信度為99.99%，回歸方程顯著，說明此方程有較好的擬合度，方程與實(shí)際情況比較相符，并能作出相對(duì)準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。如果P＜0.05，則說明模型中項(xiàng)的影響是顯著的。在這個(gè)模型中，X1、X1X3、系數(shù)的置信度均在95%水平以上，說明它們都為模型的顯著項(xiàng)。

表5 中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Tab.5 The analysis of variance of central composite experimental results

分別以谷氨酸鈉和酵母粉濃度(圖1A)、谷氨酸鈉和MgSO4濃度(圖1B)、酵母粉和MgSO4濃度(圖1C)作為平面坐標(biāo)，γ-PGA的水平作為響應(yīng)值，繪制了三維響應(yīng)面和等高線圖，可看出從圖中均可找到一個(gè)γ-PGA水平的最大值。通過擬合方程分別對(duì)各自變量求偏導(dǎo)數(shù)，并令各偏導(dǎo)數(shù)為0，可得一個(gè)二元一次方程組，求解得到最大產(chǎn)γ-PGA量對(duì)應(yīng)的最優(yōu)化條件為酵母粉 27.20 g/L、谷氨酸鈉76.92 g/L、MgSO40.26 g/L，預(yù)測(cè) γ-PGA 的水平最大值為56.4 g/L。

為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)值，按上述最佳發(fā)酵條件:谷氨酸鈉 76.92 g/L、酵母粉 27.20 g/L、MgSO40.26 g/L、蔗糖50 g/L、K2HPO4·3H2O 2 g/L、NaCl 5 g/L、接種量5%、pH 7，做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到γ-PGA水平的最大值為56.9 g/L，基本與響應(yīng)面預(yù)測(cè)的最大γ-PGA水平符合，說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的數(shù)學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合的較好。在初始發(fā)酵培養(yǎng)條件，γ-PGA的水平為29.4 g/L，響應(yīng)面法優(yōu)化后γ-PGA的水平提高到56.9 g/L，增加了93.5%。

本文通過PB設(shè)計(jì)法和響應(yīng)面分析法，用較少的試驗(yàn)對(duì)Bacillus subtilis S18的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，谷氨酸鈉、酵母粉和MgSO4為影響γ-PGA發(fā)酵水平的重要影響因子。

圖1 γ-PGA水平為響應(yīng)值的曲面和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots for the effects on the yield ofγ-PGA

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Response surface analysis ofγ-polyglutamic acid fermentation conditions

LIU Qing-zhi1，LI Xia2，SU Yi-shan2，ZHU Xi-qiang2，GUO Xue-ping1，2
(1.School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China;2.Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province，Jinan 250101，China)

Purpose To improve the fermentation yield ofγ-polyglutamic acid(γ-PGA)by optimizing the fermentation conditions of Bacillus subtilis S18.Methods A Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of eight variables on the production ofγ-PGA.The method of steepest ascent(descent)was used to approach the optimal response surface experimental area.The optimal conditions for fermentation were obtained by central composite design and response surface analysis.Finally，the experimental results were verified.Results It was indicated that glutamic sodium，yeast powder and MgSO4had significant influences on the production ofγ-PGA by Plackett-Burman design.After the level of center was determined by the method of steepest ascent(descent)，the optimal concentrations of glutamic sodium，yeast powder and MgSO4could be obtained by central composite design and they were 76.92 g/L，27.20 g/L and 0.26 g/L，respectively.The fermentation yield of γ-PGA could be up to 56.9 g/L.Conclusion The γ-PGA production in the optimized medium can be increased by 93.5%than before.

γ-polyglutamic acid;fermentation;Plackett-Burman design;response surface analysis;Bacillus subtilis S18

TQ464.7

A

1005-1678(2011)02-0099-04

2009-12-28

劉青芝，女，碩士研究生，主要從事生物制藥工藝研究;郭學(xué)平，男，通信作者，研究員，Tel:0531-82685555，E-mail:guo-xp@139.com。