嚴晨之， 曹 雪， 周 磊,3*， 修光利,3

1.華東理工大學資源與環(huán)境工程學院, 國家環(huán)境保護化工過程環(huán)境風險評價與控制重點實驗室, 上海 200237 2.華東理工大學資源與環(huán)境工程學院, 上海市環(huán)境保護化學污染物環(huán)境標準與風險管理重點實驗室, 上海 200237 3.上海污染控制與生態(tài)安全研究院, 上海 200092

PAEs (phthalatic acid esters，鄰苯二甲酸酯)是一類常用的增塑劑，用于提高塑料的柔韌性和彈性，也被廣泛應用于化妝品、個人護理產(chǎn)品、食品包裝和醫(yī)療產(chǎn)品等領(lǐng)域，屬于內(nèi)分泌干擾物[1-2]. 目前全世界范圍內(nèi)廣泛使用的PAEs包括DEHP 〔di-(2-etylhexyl) phthalate，鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯〕、DBP (dibutyl phthalate，鄰苯二甲酸二丁酯)、DIBP (diisobutyl phthalate，鄰苯二甲酸二異丁酯)[3]. 由于在人類生產(chǎn)活動中的大量使用和較高的持久性，PAEs已成為普遍存在的環(huán)境污染物. 該類物質(zhì)能以浸出、遷移、蒸發(fā)等方式進入環(huán)境，通過皮膚接觸、呼吸、飲食等途徑被人體吸收、攝入，最終對人體產(chǎn)生潛在的危害作用[4-5]. PAEs的暴露引起了人們的關(guān)注，其與人類的健康風險密切相關(guān)，特別是易感人群，如孕婦、嬰兒和兒童等[6].

研究[7]表明，DEHP等傳統(tǒng)PAEs對環(huán)境和人體存在顯著毒性影響，因此歐盟出臺了相關(guān)政策禁止該類物質(zhì)在玩具和嬰幼兒用品中使用，新的PAEs作為替代品被引入. DEP (diethyl phthalate，鄰苯二甲酸二乙酯)作為一種新型增塑劑，已經(jīng)在各行各業(yè)中被廣泛使用[8]. 因其大量被工業(yè)化生產(chǎn)并使用，使得DEP在水、土壤、大氣環(huán)境介質(zhì)中不斷被檢出[9]. 研究[10]表明，DEP在飲用水、工業(yè)廢水、河流中的濃度分別為 0.000 01～0.004 6、0.000 01～0.060、0.000 06～0.044 mgL；在室內(nèi)空氣中的濃度為1.6～2.03 μgm3，在室外空氣中的濃度為0.4～0.52 μgm3. 此外，在食品中也檢測到了DEP的存在，其在紙包裝材料、瓶裝水及牛奶中的含量分別為41 mgkg、0.02～0.25 μgL、0.22～1.45 μgL[11]. DEP是小分子量的PAEs，與其他PAEs相比，其因缺乏與主體材料結(jié)合的共價鍵而具有相對高的水溶性，所以DEP更容易進入水生環(huán)境，對生態(tài)環(huán)境和人體造成影響. 已有研究[12-13]報道，DEP暴露會降低生物體內(nèi)的抗氧化性能、引起細胞凋亡，還能干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)，影響兒童的智力發(fā)育等，具有“三致”毒性. 平令文等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在DEP(0.1～50 mgkg)脅迫下,蚯蚓機體和DNA出現(xiàn)一定程度的損傷，蚯蚓的抗氧化酶防御系統(tǒng)呈激活狀態(tài)，表現(xiàn)出較強的生態(tài)毒理效應. Shirsha等[15]發(fā)現(xiàn)，暴露于DEP的小鼠精子中存在大量的結(jié)構(gòu)異常，精子功能下降，揭示了PARP-1 (poly ADP-ribose polymerase，DNA修復酶)的過度激活以及誘導細胞凋亡的精子分裂是DEP介導精子病理的關(guān)鍵機制. XU等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于DEP會對斑馬魚胚胎產(chǎn)生潛在的神經(jīng)毒性影響，在DEP濃度為500 μgL時影響尤為顯著；在DEP濃度為50 μgL時，會影響斑馬魚胚胎體內(nèi)的ROS(活性氧自由基)水平、干擾氧化平衡、破壞免疫系統(tǒng). HU等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在DEP濃度為10～100 mgkg的毒性范圍內(nèi)，小鼠的體質(zhì)量顯著下降，體內(nèi)胎兒睪丸間質(zhì)細胞變小，個數(shù)增加，對子宮發(fā)育產(chǎn)生不利影響. 目前，DEP已經(jīng)被美國環(huán)境保護局確認為優(yōu)先控制的有毒污染物之一，同時我國也將其確定為環(huán)境優(yōu)先控制污染物之一[19]. 然而，作為傳統(tǒng)PAEs的替代品，DEP的毒性效應卻尚未引起關(guān)注.

秀麗隱桿線蟲廣泛存在于土壤孔隙水中，其通體透明，壽命和生命周期短易于實驗室培養(yǎng)觀察[20]. 目前，秀麗隱桿線蟲已經(jīng)完成全基因組測序，其與人體60%～80%的基因有相似性，且與人類共同擁有17條信號轉(zhuǎn)導通路中的12條[21]. 近年來，秀麗隱桿線蟲已經(jīng)發(fā)展成一種環(huán)境毒理學研究的重要動物模型，它對環(huán)境毒性非常敏感，能用多種指標測試終點來評價環(huán)境污染物的毒性效應[22]. 該研究選擇秀麗隱桿線蟲的體長、體寬、頭部擺動頻率3個生理指標來評估暴露于環(huán)境濃度的DEP溶液對秀麗隱桿線蟲發(fā)育和運動行為的影響，選取ROS、細胞凋亡和脂褐素水平3個生化指標來闡明影響秀麗隱桿線蟲發(fā)育和運動行為變化的原因，以期為評估DEP的生態(tài)安全性提供理論數(shù)據(jù)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 主要儀器試劑

儀器：舜宇光學科技(集團)有限公司SZM45B1型體視顯微鏡；尼康儀器(上海)有限公司Nikon Eclipse 80i熒光顯微鏡；奧林巴斯(中國)有限公司CX31生物顯微鏡；上海申安醫(yī)療機械廠LDZF立式高壓滅菌器；上海一恒科技有限公司LRH生化培養(yǎng)箱.

試劑： DEP (純度為99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司);二甲基亞砜(DMSO，純度為99%，上海吉至生化科技有限公司)；2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(H2DCFDA，純度為97%，阿拉丁試劑上海有限公司)；吖啶橙(C17H19N3，純度為99%,阿拉丁試劑上海有限公司).

1.2 秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)和同步化方法

將處于產(chǎn)卵期的秀麗隱桿線蟲〔N2野生型，購于國線蟲遺傳中心(CGC)〕從NGM (nematode growth medium，線蟲生長培養(yǎng)基)培養(yǎng)基上沖洗至離心管中,加入等體積裂解液(1.6 molL NaOH、3.3% HClO)，搖晃至充分混勻，在 3 000 rmin轉(zhuǎn)速下離心2 min，吸除上層液體，底部沉淀用無菌K液清洗，清洗3遍，最終得到的裂解后蟲卵轉(zhuǎn)移到涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基上，在20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h得到L1期秀麗隱桿線蟲用于72 h暴露試驗，培養(yǎng)48 h得到L4期秀麗隱桿線蟲用于24 h和10 d暴露試驗[23].

1.3 DEP溶液的配置及染毒方法

1.3.1DEP溶液的配置

因DEP不溶于水，故選擇DMSO作為助溶劑(最終體積分數(shù)為0.01%). 采用等梯度稀釋法配置DEP溶液. 由預試驗結(jié)果可知，24 h DEP對秀麗隱桿線蟲的LC50 (半致死濃度)為27.591 mg/L，根據(jù)DEP環(huán)境濃度范圍及LC50，試驗配置的DEP溶液濃度為0(對照組)、0.000 2、0.002、0.02、0.2、2 mg/L.

1.3.2染毒方法

根據(jù)秀麗隱桿線蟲的生命周期特點，選取24 h、72 h、10 d作為暴露時間. 根據(jù)傳統(tǒng)線蟲暴露試驗方法(急性、亞急性、慢性暴露)，將L1期的秀麗隱桿線蟲于DEP濃度為0、0.000 2、0.002、0.02、0.2、2 mg/L的溶液中暴露72 h，將L4期的秀麗隱桿線蟲于DEP濃度為0、0.000 2、0.002、0.02、0.2、2 mg/L的溶液中暴露24 h或10 d.

1.4 體長和體寬的測定

暴露試驗結(jié)束后，將秀麗隱桿線蟲從DEP溶液中吸出，用無菌K液沖洗3遍. 高溫殺死收集到的秀麗隱桿線蟲，吸取部分秀麗隱桿線蟲置于載玻片上，將載玻片置于生物顯微鏡下進行拍攝，將捕獲到的圖片利用Image J軟件進行數(shù)據(jù)處理，測量每條秀麗隱桿線蟲的體長和體寬，每組至少處理60條秀麗隱桿線蟲[24].

1.5 頭部擺動頻率的測定

將暴露試驗結(jié)束后的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到未涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基上，置于生物顯微鏡下，待其穩(wěn)定1 min后再進行觀察. 秀麗隱桿線蟲頭部從一側(cè)擺動到另一側(cè)記為1次，記錄1 min內(nèi)秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率，每組記錄30條秀麗隱桿線蟲[25].

1.6 ROS的測定

暴露試驗結(jié)束后，收集秀麗隱桿線蟲進行ROS測定. 用H2DCFDA (2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯)熒光探針法來檢測秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS的水平[26]. 收集不同暴露濃度下的秀麗隱桿線蟲于離心管中，用無菌K液沖洗3遍，然后在各暴露濃度組中分別加入1 mL 1 μmol/L的H2DCFDA，放入20 ℃的無菌生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 h后取出. 用無菌K液沖洗3遍，將處理后的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到2%的瓊脂墊上，并用60 μmol/L的左旋咪唑溶液麻醉，在Nikon Eclipse 80i型熒光顯微鏡(日本)下進行拍攝〔熒光顯微鏡濾鏡選擇異硫氰酸熒光素(FITC)〕，觀察在DEP溶液中暴露后秀麗隱桿線蟲各部分的ROS水平.

1.7 脂褐素的測定

DEP溶液暴露結(jié)束后，收集秀麗隱桿線蟲進行脂褐素測定. 將收集的秀麗隱桿線蟲用無菌K液沖洗3遍后轉(zhuǎn)移到2%的瓊脂墊上，并用60 μmol/L的左旋咪唑溶液麻醉，在Nikon Eclipse 80i型熒光顯微鏡(熒光顯微鏡濾鏡選擇UV-2A)下進行拍攝，觀察在DEP溶液中暴露后秀麗隱桿線蟲各部分的脂褐素水平[27].

1.8 細胞凋亡水平的測定

DEP溶液暴露結(jié)束后，收集秀麗隱桿線蟲進行細胞凋亡水平測定. 用吖啶橙染色法來檢測秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的細胞凋亡水平[28]. 收集暴露后的秀麗隱桿線蟲用無菌K液沖洗3遍，不同暴露組分別加入1 mL 25 μg/mL的吖啶橙溶液，放入20 ℃的無菌生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 h后取出. 用無菌K液沖洗3遍，將處理后的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到2%的瓊脂墊上，并用60 μmol/L的左旋咪唑溶液麻醉，在Nikon Eclipse 80i型熒光顯微鏡(熒光顯微鏡濾鏡選擇FITC)下進行拍攝，觀察在DEP溶液中暴露后秀麗隱桿線蟲各部分的細胞凋亡水平.

1.9 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計以平均值±標準差的形式表示，利用SPSS 24軟件進行單因素方差(one way ANOVA)分析，采用Origin 2018軟件繪圖；同時，采用Dunnett假定等方差進行事后檢驗，統(tǒng)計無觀察效應濃度(nonlinear optimal excitation control, NOEC)[29].

2 結(jié)果與分析

2.1 DEP對秀麗隱桿線蟲發(fā)育的影響

由圖1可見：L4期秀麗隱桿線蟲在不同濃度DEP溶液中暴露24 h后，其體長和體寬均未發(fā)生顯著性變化. L1期秀麗隱桿線蟲暴露于2 mgL DEP溶液中72 h后，體長出現(xiàn)了顯著性下降，與對照組相比下降了3.21%(P<0.05)；暴露于 0.000 2 mg/L DEP溶液中秀麗隱桿線蟲的體寬增長；暴露于0.02和0.2 mg/L DEP溶液下秀麗隱桿線蟲的體寬均顯著增加，與對照組相比分別增加了5.07%(P<0.05)和7.11%(P<0.01)；暴露于2 mg/L DEP溶液下秀麗隱桿線蟲的體寬有所下降，與暴露于0.2 mg/L DEP溶液下的秀麗隱桿線蟲相比，其體寬下降了7.78%. L4期秀麗隱桿線蟲在不同濃度DEP溶液中暴露10 d后，其體長和體寬均呈下降趨勢. 暴露于 0.000 2 mg/L DEP溶液時，秀麗隱桿線蟲的體長明顯下降，與對照組相比下降了3.72%(P<0.01)；暴露于0.002和0.02 mg/L DEP溶液時，秀麗隱桿線蟲的體寬與對照組相比分別下降了7.62%和5.96%，且均具有統(tǒng)計學意義. 可見，暴露72 h后DEP溶液對秀麗隱桿線蟲體長、體寬影響的NOEC值分別為0.2和0.002 mg/L；暴露10 d后DEP溶液對秀麗隱桿線蟲體長、體寬影響的NOEC值均為 0.000 2 mg/L.

2.2 DEP對秀麗隱桿線蟲運動行為的影響

注： *和** 分別表示差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)，下同.圖1 不同濃度DEP溶液對秀麗隱桿線蟲發(fā)育的影響Fig.1 The effect of different DEP concentrations on the developmental endpoints of C. elegans

該研究選取秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率作為運動行為的評價指標. 由圖2可見：L4期秀麗隱桿線蟲在不同濃度DEP溶液中暴露24 h后，秀麗隱桿線蟲頭部擺動頻率均減緩，暴露于0.002 mg/L DEP溶液時顯著下降了2.79%(P<0.01)；L1期秀麗隱桿線蟲在 0.000 2 mg/L DEP溶液中暴露72 h后，秀麗隱桿線蟲頭部擺動頻率明顯加快，與對照組相比升高了5.52%(P<0.01)，并且隨著DEP濃度的增加，頭部擺動頻率呈劑量依賴性增加；L4期秀麗隱桿線蟲在不同濃度DEP溶液中暴露10 d后，秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率均減緩，但不同暴露濃度之間沒有顯著性差異. 可見，暴露24 h后DEP溶液對秀麗隱桿線蟲頭部擺動頻率影響的NOEC值為 0.000 2 mg/L，暴露72 h后DEP溶液對秀麗隱桿線蟲頭部擺動頻率影響的NOEC值為 0.000 2 mg/L；同時，暴露于DEP溶液10 d后秀麗隱桿線蟲的運動速率較暴露于DEP溶液24和72 h時均減緩，說明長時間暴露于DEP溶液會導致秀麗隱桿線蟲產(chǎn)生運動行為上的缺陷.

圖2 不同濃度DEP溶液對秀麗隱桿線蟲頭部擺動頻率的影響Fig.2 The effect of different DEP concentrations on head thrashes frequency of C. elegans

2.3 DEP對秀麗隱桿線蟲生化水平的影響

2.3.1DEP對秀麗隱桿線蟲ROS水平的影響

ROS包含H2O2和羥基自由基等. 在正常情況下生物體內(nèi)的氧化和抗氧化過程會維持動態(tài)平衡，一旦外界環(huán)境對生物體產(chǎn)生刺激作用，生物體內(nèi)ROS累積，則會打破生物體內(nèi)的動態(tài)平衡，從而引起生物體的氧化應激損傷[30]. 該研究發(fā)現(xiàn)，當L4期秀麗隱桿線蟲暴露于DEP溶液24 h后，DEP并未干擾秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)情況. 由圖3可見：當L4期秀麗隱桿線蟲暴露于DEP溶液10 d后，在DEP濃度為 0.000 2～0.2 mg/L時，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS水平略有上升，但沒有顯著性變化；而DEP濃度為2 mg/L時，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS水平出現(xiàn)了顯著性增長，可以明顯觀察到線蟲體內(nèi)熒光強度增加，出現(xiàn)局部性亮塊，與對照組相比升高了8.80%(P<0.05). 可見，DEP溶液對秀麗隱桿線蟲ROS水平影響的NOEC值為0.2 mg/L，隨著暴露濃度的升高，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)活性氧累積程度增加，出現(xiàn)氧化應激損傷現(xiàn)象.

2.3.2DEP對秀麗隱桿線蟲脂褐素水平的影響

注： 各生化指標水平計算公式為(試驗組熒光強度對照組熒光強度)×100%.圖3 暴露于DEP溶液10 d對秀麗隱桿線蟲生化指標的影響Fig.3 The effect of DEP on the biochemical endpoints of C.elegans under 10 d exposure

脂褐素是秀麗隱桿線蟲面對周圍不利環(huán)境時做出反應的重要生物指標. 脂褐素水平在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)累積越高，說明其體內(nèi)細胞損傷程度越高. 由圖3可見：L4期秀麗隱桿線蟲暴露于DEP溶液10 d后秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂褐素累積增加. 在DEP濃度為 0.000 2～0.2 mg/L時，與對照組相比，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂褐素水平均沒有出現(xiàn)顯著變化；而在DEP濃度為2 mg/L時，與對照組相比，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂褐素積累增長了21.81%(P<0.05)，可以觀察到線蟲體內(nèi)熒光強度增加. 可見，DEP溶液對秀麗隱桿線蟲脂褐素水平影響的NOEC值為0.2 mg/L，脂褐素水平累積增長，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)細胞損傷情況加劇，最終對秀麗隱桿線蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生負面影響.

2.3.3DEP對秀麗隱桿線蟲細胞凋亡水平的影響

細胞凋亡是指正常細胞受到不利環(huán)境的刺激，最終死亡的過程[31]. 細胞凋亡也是用于評價環(huán)境污染物毒性的重要指標. 由圖3可見，L4期秀麗隱桿線蟲暴露于 0.000 2～0.2 mg/L的DEP溶液10 d后，體內(nèi)細胞凋亡水平并未出現(xiàn)顯著改變，而在DEP濃度為2 mg/L時秀麗隱桿線蟲體內(nèi)細胞凋亡水平顯著上升了8.61%(P<0.05)，可以明顯觀察到線蟲體內(nèi)熒光亮度較對照組增強. 可見，DEP溶液對秀麗隱桿線蟲細胞凋亡水平影響的NOEC值為0.2 mg/L，推測DEP溶液會通過氧化應激反應在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS，最終導致體內(nèi)細胞凋亡.

3 討論

PAEs是一種環(huán)境類激素污染物，其對生物體的生殖發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)都會造成功能性損害[32]. 日常生活中塑料制品的廣泛使用，使得PAEs大量存在于各種環(huán)境介質(zhì)中. 該研究發(fā)現(xiàn)，DEP暴露會對秀麗隱桿線蟲的生長發(fā)育及運動行為造成缺陷，且不同暴露劑量和暴露時間都會對秀麗隱桿線蟲產(chǎn)生不同程度的毒性影響.

L4期秀麗隱桿線蟲暴露于不同濃度的DEP溶液24 h后，秀麗隱桿線蟲的體長體寬并沒有表現(xiàn)出顯著性變化，僅頭部擺動頻率出現(xiàn)變化，這可能與DEP在生物體內(nèi)的水解代謝和排出速率相對較快有關(guān)[33]. 短時間暴露于DEP溶液時，秀麗隱桿線蟲將DEP從體內(nèi)代謝排出，所以并未對秀麗隱桿線蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生明顯的毒性效應. 而將L1期秀麗隱桿線蟲暴露于DEP溶液72 h后，0.000 2～0.02 mgL的DEP溶液便可影響秀麗隱桿線蟲的生長發(fā)育和運動行為. 研究[34]發(fā)現(xiàn)，周圍環(huán)境變化或暴露于污染物質(zhì)時，秀麗隱桿線蟲的運動行為均會發(fā)生改變，而其運動行為的變化又主要由多種神經(jīng)元及相互間的神經(jīng)傳導信號通路控制. XU等[16]發(fā)現(xiàn)，DEP溶液對斑馬魚產(chǎn)生了神經(jīng)毒性，斑馬魚體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性受到抑制且神經(jīng)基因的表達水平發(fā)生顯著變化. 秀麗隱桿線蟲運動行為的改變進而導致攝食行為的變化，最終對秀麗隱桿線蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響. 在L1期秀麗隱桿線蟲暴露于DEP溶液72 h的試驗中，暴露于0.02 mgL的DEP溶液時秀麗隱桿線蟲體寬增加，同時其頭部擺動頻率加快，說明秀麗隱桿線蟲極有可能以促進生長發(fā)育的形式來彌補暴露后對其運動行為造成的不利影響. 此外，L4期秀麗隱桿線蟲暴露于DEP溶液10 d后，秀麗隱桿線蟲生長發(fā)育和運動行為均出現(xiàn)缺陷，體內(nèi)生化指標發(fā)生變化，出現(xiàn)氧化應激損傷和細胞損傷情況. 其中，ROS作為氧化應激的產(chǎn)物，可通過干擾抗氧化和氧化系統(tǒng)的平衡來介導細胞凋亡，進而加速秀麗隱桿線蟲的衰老死亡，干擾秀麗隱桿線蟲的正常生長發(fā)育水平[35-37]. Pradhan等[8]研究了DEHP和DEP對秀麗隱桿線蟲脂質(zhì)代謝、繁殖能力和壽命的影響，發(fā)現(xiàn)與氧化應激和細胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄均受到DEHP和DEP的影響，其中ced-1、wah-1、gst-4、cth-2，hsp16基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，最終損害脂質(zhì)代謝、降低繁殖能力、縮短秀麗隱桿線蟲壽命.

通過比較DEP對秀麗隱桿線蟲體長、體寬、頭部擺動頻率和3個生化指標影響的NOEC值可以發(fā)現(xiàn)，L4期秀麗隱桿線蟲暴露于DEP溶液24 h時，未檢出DEP對秀麗隱桿線蟲體長和體寬影響的NOEC值，DEP對頭部擺動頻率影響的NOEC值為 0.000 2 mg/L；L1期秀麗隱桿線蟲暴露于DEP溶液72 h時，DEP對秀麗隱桿線蟲體長、體寬和頭部擺動頻率影響的NOEC值分別為0.2、0.002、0.000 2 mg/L；L4期秀麗隱桿線蟲暴露于DEP溶液10 d時，未檢出DEP對秀麗隱桿線頭部擺動頻率影響的NOEC值，DEP對秀麗隱桿線蟲體長、體寬影響的NOEC值均為 0.000 2 mg/L，對ROS、脂褐素和細胞凋亡水平影響的NOEC值均為0.2 mg/L. 在同一暴露時間下，不同生理指標的敏感性不同. 在DEP溶液中暴露24 h時，秀麗隱桿線蟲生理指標的敏感性順序為頭部擺動頻率>體長、體寬；在DEP溶液中暴露72 h時，秀麗隱桿線蟲生理指標的敏感性順序為頭部擺動頻率>體寬>體長；在DEP溶液中暴露10 d時，秀麗隱桿線蟲生理指標的敏感性順序為體長、體寬>頭部擺動頻率. 對于生化指標而言，在DEP溶液中暴露10 d時，秀麗隱桿線蟲3個生化指標的敏感性一致.

該研究也發(fā)現(xiàn)，只有在較高濃度(0.2和2 mg/L)或長期暴露(72 h和10 d)情況下，DEP才會對秀麗隱桿線蟲表現(xiàn)出明顯的毒性效應，在低濃度或短時間暴露情況下，DEP并未對秀麗隱桿線蟲表現(xiàn)出明顯的毒性效應，這可能是由于PAEs類物質(zhì)的毒性與其溶解度成反比，且與其結(jié)構(gòu)有關(guān)[38]. DEP有較高的水溶性且分子結(jié)構(gòu)較小，單獨存在時毒性弱于與其他物質(zhì)混合時的毒性. 環(huán)境中PAEs類物質(zhì)經(jīng)常是以混合物的形式存在，DEP的加入可能會導致化合物的協(xié)同作用，使得混合存在的PAEs毒性增強[39]. 與暴露于DEHP后秀麗隱桿線蟲表現(xiàn)出的急性毒性[40]相比，暴露于DEP溶液中也對秀麗隱桿線蟲產(chǎn)生了毒性影響. 因DEP在環(huán)境中的持久性及生物富集性，其對于人體的危害影響仍不能忽視.

4 結(jié)論

a) L4期秀麗隱桿線蟲在不同濃度DEP溶液中暴露24 h后，與對照組相比，秀麗隱桿線蟲的體長、體寬均未受到顯著影響，表明短時間暴露于DEP溶液對秀麗隱桿線蟲的生長發(fā)育無顯著性影響.

b) L1期秀麗隱桿線蟲在不同濃度DEP溶液中暴露72 h后，在DEP溶液濃度為2 mgL時，秀麗隱桿線蟲的體長顯著下降了3.21%；在DEP溶液濃度為 0.000 2 mgL時，秀麗隱桿線蟲的體寬呈上升趨勢，與對照組相比，頭部擺動頻率顯著增加了5.52%. 結(jié)果表明，將生長期的秀麗隱桿線蟲暴露于DEP溶液會對秀麗隱桿線蟲的發(fā)育及運動行為造成缺陷.

c) L4期秀麗隱桿線蟲在不同濃度DEP溶液中暴露10 d后，在DEP溶液濃度為 0.000 2 mgL時，秀麗隱桿線蟲的體長明顯下降了3.72%；在DEP溶液濃度為0.002 mgL時，秀麗隱桿線蟲的體寬下降了7.62%. 暴露于DEP溶液使得秀麗隱桿線蟲的體長體寬下降，頭部擺動頻率減緩，體內(nèi)ROS、脂褐素及細胞凋亡水平累積上升，尤其是在DEP溶液濃度為2 mgL時表現(xiàn)最為顯著. 結(jié)果表明，長時間(10 d)及高濃度DEP溶液(2 mgL)暴露會嚴重誘發(fā)秀麗隱桿線蟲發(fā)育及運動行為的缺陷，擾亂秀麗隱桿線蟲體內(nèi)系統(tǒng)平衡.

d) 對比不同濃度DEP溶液對秀麗隱桿線蟲體長、體寬和頭部擺動頻率影響的NOEC值發(fā)現(xiàn)：秀麗隱桿線蟲暴露于DEP溶液72 h時各指標敏感性大于暴露24 h和10 d時的情況. 此外，秀麗隱桿線蟲暴露于DEP溶液24 h和72 h時，頭部擺動頻率為最敏感的生理指標；秀麗隱桿線蟲暴露于DEP溶液10 d時，體長和體寬為較敏感的生理指標. 秀麗隱桿線蟲暴露于DEP溶液10 d后,ROS、脂褐素和細胞凋亡水平這3個生化指標敏感性一致.