劉東明， 孟繁華， 郝 艷， 侯佳奇， 葉美瀛， 李鳴曉， 席北斗*

1.中國環(huán)境科學(xué)研究院， 環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險評估國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100012 2.中國環(huán)境科學(xué)研究院地下水污染防控研究室， 北京 100012

好氧堆肥是實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢棄物資源化利用的一種重要方式[1-2]，堆肥產(chǎn)品作為有機(jī)肥或土壤調(diào)理劑具有一定的商業(yè)價值，也可以作為載體為原位生物脫氮提供更大的比表面積和更多的微生物附著點(diǎn)[3]，進(jìn)而提高包氣帶土層防護(hù)地下水硝酸鹽污染的效果.

堆肥是否能作為生物修復(fù)菌劑的載體，與其腐熟度有關(guān)，堆肥必須完全腐熟才能作為微生物菌劑吸附載體[4]. 由于堆肥的實(shí)質(zhì)是微生物在適宜條件下的代謝作用，因此，堆肥的腐熟速度與堆體內(nèi)的微生物直接相關(guān). 研究[5-6]表明，在堆肥過程中接種高效微生物菌劑可以增加堆體中的微生物數(shù)量，加速垃圾中有機(jī)物的分解，促進(jìn)堆肥材料的腐熟，提高堆肥效率. KE等[7]研究表明，在餐廚垃圾堆肥中接種耐熱脂肪分解放線菌，能夠減少堆肥粗脂肪含量，縮短堆肥腐熟時間. SONG等[8]將耐酸菌劑接種于餐廚垃圾堆肥，結(jié)果表明堆肥初期酸化問題得到解決. 也有研究認(rèn)為，堆肥系統(tǒng)內(nèi)微生物群體的數(shù)量和種類都是足夠的，它們能夠在適合的條件下快速繁殖[9-10]，因此，可以通過刺激土著微生物的方法達(dá)到快速啟動堆肥的目的[11]. 另外，接種的微生物要與大量的土著微生物進(jìn)行競爭，不能發(fā)揮其在純培養(yǎng)條件下的物質(zhì)分解潛力[12]. 通過微生物學(xué)研究闡明菌劑和堆肥土著微生物的相互作用對提高堆肥產(chǎn)品品質(zhì)(腐熟度)至關(guān)重要.

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展開辟了堆肥原位微生物的研究途徑，變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)等依賴于DNA分析的技術(shù)被引入堆肥微生物研究[13-15]. Bonito等[13]研究表明，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，DGGE指紋技術(shù)和DNA克隆文庫序列分析法可從堆肥樣品中得到不同的真菌分類群和更高的真菌豐富度，但是，由于分辨率等原因造成的偏差，使DGGE指紋技術(shù)的檢測結(jié)果與實(shí)際微生物群落多樣性存在較大差異，從而影響了對堆肥系統(tǒng)中微生物群落的全面了解[16]. 16S rDNA 高通量測序技術(shù)基于大規(guī)模數(shù)據(jù)分析微生物群落，具有更強(qiáng)的統(tǒng)計(jì)效力，但是對PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果與實(shí)際情況仍有差異. 宏基因組學(xué)能夠直接得到某一環(huán)境條件下微生物群落的整體結(jié)構(gòu)信息，避免了試驗(yàn)偏差，但仍無法對微生物群落和功能間的關(guān)系進(jìn)行解析. 基于RNA分析的宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)通過研究特定環(huán)境群體細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的所有RNA將微生物群落和功能聯(lián)系到一起，但是其結(jié)果闡明的是微生物“準(zhǔn)備做什么”，而不是“正在做什么”. 蛋白質(zhì)尤其是酶類參與生命有機(jī)體的生物轉(zhuǎn)化過程，因此，以“特定時間點(diǎn)內(nèi)環(huán)境微生物所有蛋白質(zhì)成分的總和”為研究對象的“宏蛋白質(zhì)組學(xué)”[17]是構(gòu)建微生物功能動力學(xué)最恰當(dāng)、最全面的方法，也是了解代謝組學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制(生態(tài)系統(tǒng)中所有微生物的總代謝物信息)最重要的一步[18]. Benndorf等[19]報道了一種高效制備環(huán)境樣品總蛋白質(zhì)的方法，用此方法提取2，4-二氯苯氧乙酸污染土壤和氯苯污染地下水中的總蛋白質(zhì)并進(jìn)行分析，結(jié)果表明，宏蛋白質(zhì)組學(xué)方法在研究環(huán)境微生物群體多樣性和功能性方面較宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)更加快速.

鑒于此，該研究采用宏蛋白質(zhì)組學(xué)方法，研究餐廚垃圾堆肥過程中接種木質(zhì)纖維素混合菌劑對細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)以及功能的影響，深入分析堆肥過程中碳水化合物代謝途徑的差異性，揭示外源菌劑與堆肥土著微生物的相互作用，以期為堆肥產(chǎn)品品質(zhì)提升提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 堆肥原料

餐廚垃圾取自中國環(huán)境科學(xué)研究院食堂，麩皮購自農(nóng)貿(mào)市場，木屑購自木材加工廠，腐殖土購自花卉市場. 餐廚垃圾CN為24.3∶1，有機(jī)質(zhì)含量為80.9%，含水率為79.7%; 麩皮CN為31.4∶1，有機(jī)質(zhì)含量為88.3%，含水率為9.2%.

1.2 堆肥設(shè)備

堆肥設(shè)備購自日本靜岡制機(jī)株式會社. 如圖1所示，該裝置主體部分是有效容積為34 L的圓柱形不銹鋼罐體，高0.4 m，直徑0.33 mm，位于恒溫箱中，底部設(shè)有布?xì)獍?，由氣泵進(jìn)行布?xì)?；配有滲濾液收集裝置、供氣及計(jì)量系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)和出口氣體在線檢測儀器(O2-H2S氣體檢測儀和CO2檢測儀).

注： 1—?dú)獗茫?2—?dú)怏w流量計(jì)； 3—反應(yīng)堆； 4—溫差控制裝置； 5—恒溫箱； 6—?dú)怏w測定儀； 7—過濾裝置.圖1 試驗(yàn)反應(yīng)器示意Fig.1 Schematic diagram of experimental reactor

1.3 微生物菌劑

微生物菌劑制備：10 g腐熟堆肥(實(shí)驗(yàn)室堆制)中加入 1 000 mL蛋白胨纖維素液體培養(yǎng)基(蛋白胨5 g，NaCl 5 g，CaCO32 g，酵母粉1 g，麩皮5 g，去離子水 1 000 mL，121 ℃下滅菌20 min)中，50 ℃下靜置培養(yǎng)至108CFUmL培養(yǎng)液，備用.

微生物菌劑組成：采用稀釋涂布平板法從菌劑中分離出20株細(xì)菌和5株真菌，對細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA序列分析，對真菌進(jìn)行28S rDNA序列分析. 20株細(xì)菌分為八大類，分別是Aeribacillussp.、Bacilluslicheniformis、Bacillusthermoamylovorans、Brevibacillusborstelensis、Geobacillussp.、Lysinibacillussp.、Paenibacillusdendritiformis、Ureibacillusthermosphaericus，都屬于芽孢桿菌目(Bacillales); 5株真菌屬于Aspergillussp.，散囊菌綱(Eurotiomycetes).

1.4 試驗(yàn)方案

設(shè)添加菌劑和不添加菌劑2個處理，其中接菌組的菌劑添加量(以干質(zhì)量計(jì))為5 mL/kg. 餐廚垃圾、腐殖土、麩皮添加量(以干質(zhì)量計(jì))比例為15∶7∶1，加入一些木屑作為填充劑用來改善堆體的孔隙結(jié)構(gòu)和增加通風(fēng)效果. 調(diào)節(jié)堆肥物料初始含水率為60%左右，通風(fēng)量為0.5 L/(min·kg)(以干質(zhì)量計(jì)). 分別在堆置5、15、30 d后在堆芯處取等量樣品混勻.

1.5 總蛋白制備

采用Benndorf等[19]提取土壤中蛋白質(zhì)的方法，從堆肥樣品中提取胞內(nèi)蛋白和胞外蛋白的混合物. 稱取5 g新鮮堆肥樣品加入20 mL 0.1 mol/L的NaOH預(yù)處理30 min，10 000 r/min、20 ℃下離心20 min. 取上清液加dH2O至16 mL，并與等體積液體苯酚(10 g苯酚加1 mL dH2O)混勻，20 ℃下振蕩1 h，10 000 r/min、20 ℃下離心15 min. 取下層苯酚加入等體積dH2O洗滌，振蕩5 min后離心. 取下層苯酚加入5倍體積的0.1 mol/L的乙酸銨甲醇溶液，-20 ℃下過夜沉淀蛋白，10 000 r/min、0 ℃下離心15 min. 沉淀用10 mL 0.1 mol/L的乙酸銨甲醇溶液懸浮，-20 ℃下孵育15 min，離心，沉淀分別用2 mL 0.1 mol/L的乙酸銨甲醇溶液、2 mL的80%丙酮和2 mL的70%乙醇洗滌(洗滌過程包括懸浮、-20 ℃下孵育、離心)，干燥后的固體物質(zhì)即為堆肥樣品中的總蛋白.

1.6 電泳分離

將制備的總蛋白用適量的SDS-PAGE上樣緩沖液溶解，100 ℃下煮沸20 min，離心后取5 μL上清進(jìn)行SDS-PAGE (Mini-PROTEAN Tetra system，Bio-Rad,德國)分析(4%濃縮膠，10%分離膠)，之后用2.5%的考馬斯亮藍(lán)R250染色觀察(見圖2). 將泳道分為12段切下，委托北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行測試，胰蛋白酶消化后，肽段通過nano-LC(Ultimate 3 000，Dionex公司)分離. Trap柱為Acclaim PePmap 100，75 μm×2 cm，Trap接頭為nanoviper，C18，3 μm，100A (Thermo scientific公司)；分析柱為自制噴針一體柱，填料為Venusil×BPC，C18(L)，3.0 μm，150 mm×0.075 mm (Agela Technologies公司)，MS/MS (Q Exactive, Thermo Scientific公司).

圖2 堆肥樣品總蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE of total proteins in composting samples

1.7 蛋白質(zhì)鑒定

MS/MS檢索采用Mascot (http://www.matrixscience.com)搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫SwissProt2013 xyzzy (539 616 sequences；191 569 459 residues)，搜索參數(shù)見表1. 所有蛋白質(zhì)以BLASTP人工注釋，記錄最相似的蛋白質(zhì)名稱和來源微生物.

表1 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物群落差異性分析

接菌組和對照組2個處理中共鑒定到 1 022個蛋白，其中，接菌組499個蛋白(435個細(xì)菌蛋白和 64個真菌蛋白)，對照組523個蛋白(338個細(xì)菌蛋白和185個真菌蛋白). 細(xì)菌蛋白主要來源于Gammaproteobacteria綱(相對豐度為46.2%～56.8%)、Bacilli綱(相對豐度為6.4%～16.0%)和Betaproteobacteria綱(相對豐度為5.3%～11.5%)，真菌蛋白主要來源于Saccharomycetes綱(相對豐度為26.6%～48.1%)和Eurotiomycetes綱(相對豐度為10.8%～32.8%)(見圖3). 為了研究群落組成的差異性，Gammaproteobacteria綱細(xì)菌又被分成Pseudomonadales目、Enterobacteriales目和other Gammaproteobacteria綱. 與對照組相比，接菌組中Pseudomonadales目細(xì)菌占比由15.1%升至27.6%，Bacilli綱細(xì)菌占比由16.0%降至6.4%，Eurotiomycetes綱真菌占比由10.8%升至32.8%，Saccharomycetes綱真菌占比由48.1%降至26.6%.

圖3 細(xì)菌和真菌群落組成和相對豐度Fig.3 Bacterial and fungal community composition and relative abundance in the metaproteome

分析結(jié)果顯示，添加菌劑使堆肥系統(tǒng)中的微生物群落發(fā)生了一定改變，細(xì)菌中Bacilli綱的數(shù)量減少，成為次要群落，但在菌劑中Bacilli綱是主要微生物群落，即菌劑中的優(yōu)勢菌群進(jìn)入堆肥系統(tǒng)后，非但沒有鞏固Bacilli綱的優(yōu)勢地位，反而使之退化為次要群落. 在真菌中，Eurotiomycetes綱的數(shù)量增加，成為優(yōu)勢菌群，而微生物菌劑中的優(yōu)勢菌群Aspergillus屬正是屬于Eurotiomycetes綱.

2.2 碳水化合物代謝功能差異性分析

碳水化合物代謝是堆肥過程中的主要代謝類型. 在接菌組和對照組中共檢測到146個與碳水化合物代謝相關(guān)的蛋白(見表2)，占全部蛋白質(zhì)的14.3%. 在接菌組中，碳水化合物酶主要來源于Pseudomonadales目(17個)和Enterobacteriales目細(xì)菌(12個)、Actinobacteria綱放線菌(6個)、Eurotiomycetes綱真菌(9個)，數(shù)量均多于對照組，而對照組中碳水化合物酶來源于Bacilli綱細(xì)菌(10個)和Saccharomycetes綱真菌(12個). 結(jié)果表明，微生物菌劑增強(qiáng)了Gammaproteobacteria綱細(xì)菌的功能，尤其是Pseudomonadales目和Enterobacteriales目細(xì)菌的功能，以及Actinobacteria綱細(xì)菌和Eurotiomycetes綱真菌的功能，抑制了Bacilli綱細(xì)菌和Saccharomycetes綱真菌的功能. Pseudomonadales目細(xì)菌和Eurotiomycetes綱真菌在功能上取代了Bacilli綱細(xì)菌和Saccharomycetes綱真菌而成為了優(yōu)勢群落.

表2 堆肥樣品中檢測到的碳水化合物酶

木質(zhì)纖維素的降解在堆肥過程中起到關(guān)鍵作用，纖維素和半纖維素是堆肥中的主要碳源，為生物轉(zhuǎn)化提供能量，而木質(zhì)素是腐植酸形成過程中重要的起始物質(zhì)[20]. 在接菌組和對照組中共鑒定到9種木質(zhì)纖維素酶，接菌組中Thermobifida屬放線菌產(chǎn)纖維素酶(1個)，Aspergillus屬(Eurotiomycetes綱)真菌產(chǎn)纖維素酶(4個)和半纖維素酶(1個)，Melanocarpus屬(Sordariomycetes綱)真菌產(chǎn)木質(zhì)素酶(1個)，對照組中Bacillus屬(Bacilli綱)細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶(1個)，Aspergillus屬真菌產(chǎn)半纖維素酶(1個)(見表3). Eurotiomycetes綱的Aspergillus屬真菌是堆肥過程中降解木質(zhì)纖維素的主要微生物，添加菌劑增強(qiáng)了其分泌纖維素酶的能力. 添加菌劑也增強(qiáng)了木質(zhì)素的分解作用，但是由于腐殖酸的形成不需要木質(zhì)素完全分解，所以產(chǎn)木質(zhì)素酶的微生物沒有成為優(yōu)勢群落. Sánchez[21]研究表明，Basidiomycota門真菌是最高效的木質(zhì)素降解功能微生物，但是筆者在試驗(yàn)中并沒有檢測到Basidiomycota門真菌產(chǎn)木質(zhì)素酶，而且Basidiomycota門的真菌蛋白占比僅為4.7%～4.9%(見圖3). 在木質(zhì)纖維素降解過程中Basidiomycota門的真菌在豐度和活性上均不占優(yōu)勢.

2.3 碳水化合物代謝途徑分析

表3 堆肥樣品中檢測到的木質(zhì)纖維素酶

如圖4所示，堆肥過程中的碳水化合物代謝途徑主要包括纖維素降解(Cellulose degradation)、木質(zhì)素降解(Lignin degradation)、半纖維素降解(Hemicellulose degradation)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、糖酵解(Glycolysis)、丙酮酸代謝(Pyruvate metabolism)、三羧酸循環(huán)(TCA cycle)、乙醛酸循環(huán)(Glyoxylate cycle)、磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway)、氨基糖和核苷酸糖代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、丙酸代謝(Propanoate metabolism)、丁酸代謝(Butanoate metabolism)、磷酸肌醇代謝(Inositol phosphate metabolism).

堆肥過程中細(xì)菌和真菌最關(guān)鍵的功能是產(chǎn)生纖維素酶[20]. 降解纖維素需要3種類型的酶，即內(nèi)切葡聚糖酶(Endoglucanase)、外切葡聚糖酶(Exoglucanase)和β-葡糖苷酶(β-glucosidase)[20,22]. 接菌組中檢測到內(nèi)切葡聚糖酶(圖4中酶1，下同)和β-葡糖苷酶(酶2)，而在對照組中僅檢測到內(nèi)切葡聚糖酶. 內(nèi)切葡聚糖酶能將可溶性纖維素水解成還原性寡糖，但是過量的水溶性寡糖尤其是纖維二糖會抑制纖維素酶的表達(dá)和活性，影響纖維素的降解[23]. β-葡糖苷酶可以將纖維二糖水解成葡萄糖以消除這種抑制作用[22]. 因此，接菌組中的纖維素在堆肥過程中獲得了有效降解. 在接菌組中檢測到一種木質(zhì)素降解酶——漆酶(Laccase). 漆酶是一組對雙酚藍(lán)銅氧化酶，它對木質(zhì)素的降解機(jī)制尚不清楚，而且一些降解木質(zhì)素的真菌并不產(chǎn)生漆酶，說明在降解木質(zhì)素的過程中漆酶并不是必要的，但是毫無疑問在產(chǎn)生漆酶的白腐菌對木質(zhì)素的分解過程中，漆酶也起著重要的作用[24]. Eggert等[25-27]發(fā)現(xiàn)，紅栓菌(Pycnoporuscinnabarinus)僅產(chǎn)生漆酶作為唯一的分解木質(zhì)素的酶，并且提出了一種新的木質(zhì)素聚合物降解系統(tǒng).

注： 僅在接菌組發(fā)現(xiàn)的酶用紅色高亮數(shù)字序號表示，僅在對照組發(fā)現(xiàn)的酶用藍(lán)色高亮數(shù)字序號表示，在接菌組和對照組都存在的酶用綠色高亮數(shù)字序號表示.1—內(nèi)切葡聚糖酶； 2—β-葡糖苷酶； 3—漆酶； 4—D-木糖還原酶； 5—D-木酮糖激酶； 6—1,4-α-葡聚糖分支酶； 7—葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶； 8—1,3-β-葡聚糖合酶； 9—葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶； 10—6-磷酸果糖激酶； 11—果糖二磷酸醛縮酶； 12—磷酸丙糖異構(gòu)酶； 13—甘油醛-3-磷酸脫氫酶； 14—磷酸甘油酸激酶； 15—依賴2,3-磷酸甘油酸的磷酸甘油酸變位酶； 16—烯醇酶； 17—磷酸烯醇丙酮酸羧激酶； 18—磷酸烯醇丙酮酸羧化酶； 19—果糖-1,6-二磷酸酯酸； 20—丙酮酸脫氫酶； 21—丙酮酸脫氫酶； 22—乙醛脫氫酶； 23—磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶； 24—丙酮酸磷酸雙激酶； 25—丙酮酸羧化酶； 26—檸檬酸合酶； 27—烏頭酸水合酶； 28—異檸檬酸脫氫酶； 29—2-酮戊二酸脫氫酶； 30—琥珀酰輔酶A連接酶； 31—琥珀酸脫氫酶； 32—蘋果酸脫氫酶； 33—異檸檬酸裂合酶； 34—蘋果酸合酶； 35—6-磷酸葡糖酸脫氫酶； 36—轉(zhuǎn)醛醇酶； 37—磷酸戊糖變位酶； 38—磷酸葡萄糖胺變位酶； 39—UDP-葡萄糖-6-脫氫酶 40—異丙醇脫氫酶； 41—丙酮醛合酶； 42—2-檸檬酸甲酯合成酶； 43—乙酰乙酰輔酶A還原酶； 44—肌糖-2-脫氫酶； 45—磷脂酰肌醇-4-激酶.圖4 微生物群落的碳水化合物代謝路徑圖Fig.4 Depiction of the carbohydrate metabolic characteristics of microbial communities inferred from the metaproteome

餐廚垃圾中含有大量易降解的碳水化合物，這些物質(zhì)降解產(chǎn)生的有機(jī)酸使堆肥初期pH下降，影響其他有機(jī)物的降解[8]. 有報道稱餐廚垃圾中最主要的有機(jī)酸是乙酸和乳酸[28]，但是筆者在該研究中并沒有檢測到與乳酸產(chǎn)生相關(guān)的酶，這可能是因?yàn)槎逊蔬^程是在反應(yīng)器中進(jìn)行，通風(fēng)條件較好，堆體中氧氣含量較高，抑制了乳酸菌的生長. 在接菌組中，乙酸、丙酸、丁酸分別進(jìn)入丙酮酸代謝、丙酸代謝和丁酸代謝途徑. 丙酮酸代謝中，乙酸主要是由乙醛(Acetaldehyde)在乙醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase，酶22)催化下生成，然后在磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(Phosphate acetyltransferase，酶23)等的催化下轉(zhuǎn)變成乙酰CoA，之后可能進(jìn)入乙醛酸循環(huán)[29]. 乙醛脫氫酶主要由Actinobacteria綱放線菌產(chǎn)生，磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶主要由Enterobacteriales目細(xì)菌產(chǎn)生. 丙酸代謝中，丙酰輔酶A (Propanoyl-CoA)在2-甲基檸檬酸合酶(2-methylcitrate synthase，酶42)催化下生成2-甲基檸檬酸(2-Methyl-citrate)，2-甲基檸檬酸經(jīng)過一系列反應(yīng)生成琥珀酸(Succinate)進(jìn)入三羧酸循環(huán)[30]. 2-甲基檸檬酸合酶主要由Eurotiomycetes綱真菌產(chǎn)生. 丁酸代謝中，乙酰乙酰輔酶A (Acetoacetyl-CoA)在乙酰輔酶A還原酶(Acetoacetyl-CoA reductase，酶43)催化下生成3-羥基丁酰輔酶A (3-Hydroxy-butanoyl-CoA)[31]，3-羥基丁酰輔酶A參與丁酸的生成，也可以生成琥珀酰輔酶A (Succinyl-CoA)進(jìn)入三羧酸循環(huán). 乙酰輔酶A還原酶主要由Pseudomonadales目細(xì)菌產(chǎn)生.

總的來說，接菌組中微生物活性較高，存在多種小分子有機(jī)酸的代謝途徑，防止了有機(jī)酸的積累；而在對照組中，有機(jī)酸代謝途徑單一，有機(jī)酸積累使pH下降，又會進(jìn)一步抑制微生物的活性，影響其他有機(jī)物的降解.

3 討論

近年來在國際上堆肥微生物接種劑的研究較多，但是對于其應(yīng)用效果的結(jié)論尚不統(tǒng)一. 有些觀點(diǎn)認(rèn)為，人工接種的微生物功能單一，無法與大量的土著微生物競爭. 為了闡明接種劑與堆肥土著微生物的相互作用，該研究采用宏蛋白質(zhì)組學(xué)方法，從分子生物學(xué)角度展開分析. 該研究所使用的菌劑主要由芽孢桿菌(Bacillales目)和曲霉(Aspergillus屬)組成. 添加菌劑后，堆肥中產(chǎn)木質(zhì)纖維素酶的真菌增多，這可能是由于堆肥系統(tǒng)中缺乏木質(zhì)纖維素分解菌，而菌劑中的曲霉是典型的木質(zhì)纖維素降解菌[32]，因此能夠適應(yīng)堆肥環(huán)境. 而菌劑中的芽孢桿菌可能不具備分解纖維素的能力，只起到穩(wěn)定菌劑體系、提供生長因子等作用，因此，進(jìn)入堆肥系統(tǒng)后，其功能不被系統(tǒng)所需要，無法與土著微生物競爭(見圖5).

餐廚垃圾堆肥系統(tǒng)所需要的功能除了分解木質(zhì)纖維素以提供碳源以外，還有促進(jìn)小分子有機(jī)酸的轉(zhuǎn)化以維持堆體酸堿平衡的功能. 對照組中，由于酵母菌(Saccharomycetes綱)能夠在酸性條件下生長，可能起到調(diào)節(jié)酸性環(huán)境、促進(jìn)嗜熱菌生長的作用[33]，因此成為了優(yōu)勢菌群. 添加菌劑后，假單胞菌(Pseudomonadales目)、腸桿菌(Enterobacteriales目)、放線菌(Actinobacteria綱)、散囊菌(Eurotiomycetes綱)的碳水化合物代謝活性增強(qiáng)，尤其是乙酸、丙酸和丁酸的轉(zhuǎn)化增強(qiáng). 雖然腸桿菌和放線菌的相對豐度沒有發(fā)生明顯變化，但是由于假單胞菌和散囊菌在小分子有機(jī)酸和木質(zhì)纖維素代謝中具有重要作用，取代了土著的酵母菌和芽孢桿菌(Bacilli綱)，在相對豐度和功能上都成為了優(yōu)勢菌群.

宏蛋白質(zhì)組學(xué)方法受數(shù)據(jù)庫分析的影響很大，數(shù)據(jù)庫的選擇影響了分析的廣度、深度以及結(jié)果的穩(wěn)定性. 目前國際上的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫較多，但是缺乏專門的堆肥微生物蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，因此該研究選擇了信息覆蓋較廣的NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)的功能注釋. 筆者相信，隨著堆肥相關(guān)數(shù)據(jù)庫的建立，宏蛋白質(zhì)組學(xué)方法能夠提供一個更加深入的視角來了解堆肥過程的分子細(xì)節(jié)，探究堆肥微生物功能演替規(guī)律.

4 結(jié)論

a) 微生物菌劑能否發(fā)揮作用，取決于菌劑是參與易降解有機(jī)物還是難降解有機(jī)物的新陳代謝作用. 堆肥系統(tǒng)中缺乏分解木質(zhì)纖維素等難降解有機(jī)物的微生物，接種木質(zhì)纖維素分解菌就會與土著菌形成協(xié)同增效；當(dāng)堆肥中由于小分子有機(jī)酸積累產(chǎn)生酸性環(huán)境時，能夠轉(zhuǎn)化有機(jī)酸的微生物群落之間就會發(fā)生競爭.

b) 堆肥土著微生物之間不是統(tǒng)一的整體，群落之間也存在競爭與演替，因此只要選擇好菌劑的功能，掌握正確的接種時機(jī)，微生物菌劑就能夠發(fā)揮原有的作用.

c) 宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是研究堆肥復(fù)雜環(huán)境下微生物相互作用的有效手段，為微生物菌劑的應(yīng)用、促進(jìn)堆肥腐植化進(jìn)程、提高堆肥產(chǎn)品品質(zhì)提供了新的視角.