謝 琦，李 娟，王鳳山

(1.桂林醫(yī)學(xué)院 生物技術(shù)學(xué)院，廣西 桂林 541004;2.山東大學(xué) 藥學(xué)院 生化與生物技術(shù)藥物研究所，山東 濟(jì)南 250012)

胸腺素α1-胸腺五肽在大腸桿菌中的表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化

謝 琦1，2，李 娟2，王鳳山2

(1.桂林醫(yī)學(xué)院 生物技術(shù)學(xué)院，廣西 桂林 541004;2.山東大學(xué) 藥學(xué)院 生化與生物技術(shù)藥物研究所，山東 濟(jì)南 250012)

目的 探討胸腺素α1-胸腺五肽(Tα1-TP5)在大腸桿菌中的表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化。方法 將化學(xué)合成的Tα1-TP5基因與原核表達(dá)載體pGEX-4T-1融合并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。利用SDS-PAGE電泳和AlphaEase凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)研究培養(yǎng)基組成、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時(shí)間等條件對(duì)融合蛋白表達(dá)量的影響。融合蛋白經(jīng)GST瓊脂糖珠親和色譜純化及重組腸激酶切割后，電噴霧質(zhì)譜鑒定Tα1-TP5。結(jié)果 選用TB培養(yǎng)基，在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期加入終濃度為0.05 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)5 h，GST融合蛋白的表達(dá)量最高，占菌體總蛋白的35.8%，且主要以可溶形式表達(dá)。Tα1-TP5的分子質(zhì)量與理論值相似。結(jié)論 Tα1-TP5成功在E.coli中表達(dá)，并確定了最佳表達(dá)條件。

胸腺素α1-胸腺五肽;胸腺融合肽;GST融合蛋白;大腸桿菌;表達(dá)條件

胸腺素 α1(Thymosin α1，Tα1)是胸腺組分 5(Thymosin fraction 5)中分離出來(lái)的由28個(gè)氨基酸組成的多肽，是一種針對(duì)T細(xì)胞的免疫增強(qiáng)劑，目前被廣泛應(yīng)用于重度感染、肝炎和腫瘤的免疫治療［1-2］。胸腺五肽 (Thymopentin，TP5)是胸腺生成素Ⅱ第32～36位的氨基酸殘基片段，具有誘導(dǎo)T細(xì)胞分化、促進(jìn)T淋巴細(xì)胞亞群發(fā)育并活化的功能。TP5主要用于治療免疫缺陷、自身免疫性疾病、傳染病、腫瘤和艾滋病等。由于Tα1和TP5具有相似的生物學(xué)活性和臨床用途，Gao等［3］對(duì)二者的融合肽Tα1-TP5在畢赤酵母中進(jìn)行了表達(dá)，活性研究表明Tα1-TP5作用效果在某些方面要大于兩者單獨(dú)使用的效果，但Tα1-TP5在畢赤酵母中的表達(dá)量不夠理想。因此，本文構(gòu)建了pGEX-4T-1/Tα1-TP5原核表達(dá)載體，并以大腸桿菌(E.coli)作為宿主菌進(jìn)行了表達(dá)。為了提高Tα1-TP5的表達(dá)量，本研究通過(guò)優(yōu)化外源基因在E.coli中表達(dá)的幾個(gè)重要影響因素，以期確立GST-Tα1-TP5融合蛋白高效表達(dá)的最佳條件，為進(jìn)一步研究Tα1-TP5融合肽的生物學(xué)活性及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)創(chuàng)造條件。

1 材料

Tα1-TP5基因及上下游引物，均由上海生工生物工程有限公司化學(xué)合成;E.coli DH5α、BL21(DE3)和載體pGEX-4T-1，均由山東大學(xué)藥學(xué)院生化與生物技術(shù)藥物研究所保存。

限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和XhoⅠ、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、低分子質(zhì)量蛋白Marker，大連寶生物公司;DNA Marker、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，天根生化科技有限公司;異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，Amresco公司;重組腸激酶，上海欣百諾生物技術(shù)有限公司;GST瓊脂糖珠，上海閃晶分子生物科技有限公司。

2 方法

2.1 pGEX-4T-1/Tα1-TP5 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

依據(jù)人源性的Tα1和TP5的分子結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了一個(gè)由三個(gè)甘氨酸構(gòu)成的連接肽將Tα1和TP5相連，Tα1和TP5分別位于融合肽的N端和C端，記作Tα1-(Gly)3-TP5基因，同時(shí)在Tα1前端加入腸激酶酶切位點(diǎn)(方框內(nèi)序列)。所合成的序列如下:5'-GAC GAC GAT GAT AAA TCT GAT GCGGCCGTT GAT ACCTCTTCTGAA ATTACGACCAAA GATCTG AAA GAA AAG AAA GAA GTG GTT GAA GAA GCG GAGAACGGCGGTGGCCGCAAA GATGTGTAC-3'。上游引物P1:5'-TAGGATCCCACCATCATCACCATCACTGTAAAACGACG-3'，下游引物 P2:5'-GCAGTCAGCACTCGAGAATGATTACGCCAAGC-3'。在上游引物中增加Bam HⅠ酶切位點(diǎn)和組氨酸標(biāo)簽，下游引物中增加XhoⅠ酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增目的基因后，瓊脂糖電泳回收目的基因。目的基因和質(zhì)粒載體pGEX-4T-1均用Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切后再回收。用T4DNA連接酶將目的基因片段與載體片段于16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，挑取單菌落，接種于含100μg/mL氨芐西林(Amp)的LB培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒pGEX-4T-1/Tα1-TP5，雙酶切鑒定，并送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

2.2 GST融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

將測(cè)序正確的 pGEX-4T-1/Tα1-TP5重組質(zhì)粒和空白質(zhì)粒pGEX-4T-1電轉(zhuǎn)化至E.coli表達(dá)菌株BL21(DE3)，分別取含有重組質(zhì)粒和空白質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌，37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)至A600值為0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)組(不加IPTG)做陰性對(duì)照，誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心收集菌體，用12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)，AlphaEase凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析樣品中所含GST融合蛋白的比例。將誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體置于冰水浴中超聲破菌，12 000 r/min離心10 min，取上清和沉淀與上述菌體一起進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白的可溶表達(dá)情況。

2.3 GST-融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基的選擇 將工程菌分別接種于含氨芐西林(Amp)的LB及TB培養(yǎng)基中，在時(shí)間、溫度、IPTG濃度等相同的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

2.3.2 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的選擇 根據(jù)2.3.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，TB培養(yǎng)基更有利于目的蛋白的表達(dá)，故以下實(shí)驗(yàn)均使用TB培養(yǎng)基。

含重組質(zhì)粒的新鮮菌液，以0.5%的接種量接種于TB液體培養(yǎng)基(含100μg/mL Amp)中，根據(jù)所測(cè)定的該菌株的生長(zhǎng)曲線，分別在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期、中期和中后期，即菌液 A600值分別為 0.5，0.9 和 1.4時(shí)，分別加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)4 h，收集菌體，進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

2.3.3 誘導(dǎo)溫度的選擇 培養(yǎng)含重組質(zhì)粒的BL21(DE3)至最佳誘導(dǎo) A600值時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，分別在25，30和37℃誘導(dǎo)4 h，收集菌體，進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

2.3.4 IPTG誘導(dǎo)濃度的選擇 培養(yǎng)含重組質(zhì)粒的BL21(DE3)至最佳誘導(dǎo)A600值時(shí)，分別加入終濃度為 0.01，0.05，0.1，1.0 和 2.0 mmol/L 的 IPTG，在最佳誘導(dǎo)溫度下誘導(dǎo)4 h，收集菌體，進(jìn)行12%SDSPAGE分析。

2.3.5 誘導(dǎo)時(shí)間的選擇 培養(yǎng)含重組質(zhì)粒的BL21(ED3)至最佳誘導(dǎo)A600值時(shí)，加入最佳誘導(dǎo)濃度的IPTG，在最佳誘導(dǎo)溫度下分別誘導(dǎo) 1，2，3，4，5 和6 h，收集菌體，進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。同時(shí)在最優(yōu)的發(fā)酵條件下，用AlphaEase凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析樣品中所含GST融合蛋白的比例。

2.4 Tα1-TP5融合肽的純化及鑒定

將誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)物離心，收集菌體并用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，超聲破碎，于4℃，8 000 r/min離心20 min。PBS平衡GST瓊脂糖珠，加入細(xì)胞裂解上清，親和吸附融合蛋白，輕柔混合10 min后棄上清。用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)清洗結(jié)合了融合蛋白GST瓊脂糖珠以除去未結(jié)合的雜蛋白。然后用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)重懸GST瓊脂糖珠，在結(jié)合了GST融合蛋白的GST瓊脂糖珠中加入重組腸激酶(37℃，16 h內(nèi)降解0.5 mg融合蛋白單位)于37℃反應(yīng)過(guò)夜，經(jīng)酶解后，GST仍結(jié)合在GST瓊脂糖珠上，而重組胸腺肽Tα1-TP5在上清中。短暫離心沉淀GST瓊脂糖珠，取上清至無(wú)菌EP管中，進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)分析。

3 結(jié)果

3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1/Tα1-TP5經(jīng)Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，可見約216 bp的特異片段，與預(yù)計(jì)片段大小一致，結(jié)果見圖1。重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序分析證實(shí)為 pGEX-4T-1/Tα1-TP5，測(cè)序結(jié)果為:TAGGATCCCACCATCATCACCATCACTGTAAAACG ACG GCCAGTGAATTCTCCGCGGGTGACGACGATG ATAAATCTGATGCGGCCGTTGATACCTCTTCTGAAA TTACGACCAAAGATCTGAAAGAAAAGAAAGAAGT GGTTGAAGAAGCGGAGAACGGCGGTGGCCGCAAA GATGTGTACTAATAAGAGCTCAA GCTTGGCGTAA TCATTCTCGAGTGCTGACTGC，其中方框內(nèi)為引物序列。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.1 Restriction map of recombinant expression vector

3.2 GST-融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

SDS-PAGE分析表明，含重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)經(jīng)誘導(dǎo)后在分子質(zhì)量32 000處有特異蛋白條帶，大小與預(yù)期相符，而未誘導(dǎo)組、空載體誘導(dǎo)組未見表達(dá)增強(qiáng)的條帶。同時(shí)通過(guò)對(duì)超聲后的上清和沉淀進(jìn)行分析可知GST-融合蛋白主要存在上清中，表明GST-融合蛋白主要以可溶的形式進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果見圖2。

圖2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed product

3.3 GST融合蛋白的最佳表達(dá)條件

3.3.1 培養(yǎng)基的選擇 在TB培養(yǎng)基中目的蛋白的表達(dá)量高于LB，結(jié)果見圖3。

圖3 目的蛋白在不同培養(yǎng)基中的表達(dá)情況Fig.3 Expression of target protein in different culture mediums

3.3.2 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的選擇 在菌體生長(zhǎng)期的各個(gè)階段加入IPTG均有目的蛋白的表達(dá)。比較發(fā)現(xiàn)，在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中后期(A600約為1.4)時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，目的蛋白的表達(dá)量最高，但只是略高于中期(A600約為0.9)，明顯高于前期。說(shuō)明在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的早期誘導(dǎo)不利于目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果見圖4。

圖4 不同時(shí)期誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)的情況Fig.4 Expression of target protein in different induction time

3.3.3 誘導(dǎo)溫度的選擇 在不同溫度(25，30，37℃)下進(jìn)行誘導(dǎo)，目的蛋白的表達(dá)量不同。在37℃時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量最高，結(jié)果見圖5。

圖5 目的蛋白在不同誘導(dǎo)溫度下的表達(dá)情況Fig.5 Expression of target protein in different induction temperatures

3.3.4 IPTG誘導(dǎo)濃度的選擇 結(jié)果見圖6。IPTG終濃度為0.01 mmol/L時(shí)即可誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，說(shuō)明工程菌對(duì)IPTG的誘導(dǎo)效應(yīng)十分敏感，較低濃度的IPTG既能啟動(dòng)目的基因的高效表達(dá)。IPTG濃度達(dá)到0.05 mmol/L后，目的蛋白的表達(dá)量不再隨IPTG濃度的增加而增加。所以對(duì)此工程菌而言，IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度是0.05 mmol/L。

圖6 不同濃度IPTG的誘導(dǎo)結(jié)果Fig.6 The target protein expression induced by IPTG at different concentrations

3.3.5 誘導(dǎo)時(shí)間的選擇 結(jié)果見圖7。加入IPTG后，目的蛋白的表達(dá)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加，至5 h達(dá)到最高，之后目的蛋白的表達(dá)不再隨時(shí)間的增加而增加。故最佳誘導(dǎo)時(shí)間為5 h。在最佳發(fā)酵條件下，工程菌表達(dá)的GST融合蛋白占全菌總蛋白的 35.8%。

3.4 胸腺融合肽Tα1-TP5的鑒定

工程菌表達(dá)的GST融合蛋白經(jīng)GST瓊脂糖珠親和純化，腸激酶切割后，含目的肽的上清液經(jīng)ESIMS分析，結(jié)果顯示其質(zhì)荷比為3 900，與Tα1-TP5的理論分子質(zhì)量相吻合。質(zhì)譜鑒定結(jié)果證明Tα1-TP5在大腸桿菌中得到了表達(dá)。

圖7 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of induction time on the expression of target protein

4 討論

Tα1是一種熱穩(wěn)定多肽，血漿半衰期(t1/2)長(zhǎng)達(dá)2 h，體內(nèi)活性較高。TP5的t1/2很短，僅有30 s，但卻能引起較長(zhǎng)時(shí)間的免疫調(diào)節(jié)效果，且極少產(chǎn)生毒副作用，是一種非常安全的藥物［4］。如果在兩個(gè)活性肽之間設(shè)計(jì)一段Linker來(lái)保證兩邊多肽的完整結(jié)構(gòu)和活性，那么由Tα1和TP5組成的融合肽不僅有可能發(fā)揮Tα1和TP5協(xié)同作用，還有可能提高TP5的t1/2，達(dá)到增效的作用。基于這樣的設(shè)想，我們構(gòu)建了pGEX-4T-1/Tα1-TP5重組表達(dá)載體，在 E.coli中實(shí)現(xiàn)了Tα1-TP5與GST基因的融合表達(dá)。

應(yīng)用重組DNA技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)入適當(dāng)宿主細(xì)胞進(jìn)行異源高效表達(dá)，是制備肽類物質(zhì)的有效方法。影響外源基因在E.coli中表達(dá)的因素很多，如啟動(dòng)子啟動(dòng)強(qiáng)度、密碼子偏愛性、載體的類型、宿主菌的特征、培養(yǎng)條件及營(yíng)養(yǎng)狀況等，而發(fā)酵條件的優(yōu)化也是蛋白表達(dá)的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化，可以提高目的蛋白的產(chǎn)量，且具有很強(qiáng)的可操作性。本研究結(jié)果表明，優(yōu)化培養(yǎng)條件可以有效提高目的蛋白的表達(dá)量，GST融合蛋白占全菌總蛋白的35.8%。這為進(jìn)一步研究胸腺融合肽Tα1-TP5的生物學(xué)活性和大規(guī)模發(fā)酵打下了基礎(chǔ)。

［1］Sugahara S，Ichida T，Yamagiwa S，et al.Thymosin-alphal increases intrahepatic NKT cells and CTLs in patients with chronic hepatitis B［J］.Hepatol Res，2002，24(4):346-354.

［2］Sasaki H，F(xiàn)ujii Y，Masaoka A，et al.Elevatedplasma thymosinalphal levels in lung cancer patients［J］.Eur J Cardiothorac Surg，1997，12(6):885-891.

［3］Gao D，Zhang X，Zhang J，et al.Expression of thymosin α1-thymopentin fusion peptide in Pichia pastoris and its characterization［J］.Arch Pharm Res，2008，31(11):1471-1476.

［4］左朋飛，韓 香，劉 璐.胸腺五肽的合成及臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.天津醫(yī)學(xué)，2008，20(1):53-57.

Expression and optimization of expression conditions of Tα1-TP5 fusion peptide in E.coli

XIE Qi1，2，LI Juan2，WANG Feng-shan2
(1.School of Biotechnology，Guilin Medical University，Guilin 541004，China;2.Institute of Biochemical and Biotechnical Drug，School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China)

Purpose To investigate the expression of Tα1-TP5 fusion peptide and optimization of the expression conditions.Methods The chemically synthesized Tα1-TP5 gene was fused with prokaryotic expression vector pGEX-4T-1 and transformed into E.coli BL21(DE3)，subsequently induced by IPTG.SDS-PAGE electrophoresis and Alpha Ease gel electrophoresis image analysis system were used to analyze the influence of culture medium，induction starting time，induction temperature，inducer concentration and induction time on the expression level of target protein.GST fusion protein was purified by GST sepharose and cut by recombinant enterokinase.Tα1-TP5 was identified by ESI-MS.Results When using TB as the medium and adding final concentration of 0.05 mmol/L of IPTG into the middle and late logarithmic phase of bacteria to induce for 5 h at 37 ℃，the expression of GST fusion protein was the highest，accounting for 35.8%of the bacterial total protein，and mainly in a soluble form.Identified by ESI-MS，the molecular weight of Tα1-TP5 was identical with theoretical value.Conclusion Tα1-TP5 has been successfully expressed in E.coli and the expression conditions of the GST fusion protein were optimized.

Tα1-TP5;fusion peptide;GST fusion protein;E.coli;expression conditions.

Q78

A

1005-1678(2011)04-0265-04

2011-03-28

謝 琦，女，講師，研究方向:多肽的合成與活性研究，Tel:0773-2295135，E-mail:xq@glmc.edu.cn; 王鳳山，男，通信作者，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:fswang@sdu.edu.cn。