尹 璐，王 敬，黃 萍，鄧雅斌，李東輝

(廈門大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 抗癌研究中心，福建 廈門 361005)

陽(yáng)離子鋁酞菁紅區(qū)熒光探針測(cè)定硫酸軟骨素

尹 璐，王 敬，黃 萍，鄧雅斌，李東輝

(廈門大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 抗癌研究中心，福建 廈門 361005)

目的 建立以陽(yáng)離子鋁酞菁為紅區(qū)熒光探針定量測(cè)定硫酸軟骨素(CS)的新方法。方法 在pH 5.0的Britton-Robinson(B-R)緩沖溶液中，陽(yáng)離子鋁酞菁與CS發(fā)生相互作用形成離子締合物而導(dǎo)致熒光猝滅。在610 nm波長(zhǎng)光的激發(fā)下，隨著CS的加入，探針的特征發(fā)射峰(676 nm)處的熒光強(qiáng)度逐步減弱。結(jié)果 在最佳條件下，熒光強(qiáng)度差值(ΔIf)與CS濃度(C，μg/mL)在0.2～1.3μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，工作曲線為 ΔIf=406.67 C－36.23，r=0.997。建立了溶劑沉淀法成功地進(jìn)行了樣品的前處理，實(shí)現(xiàn)了實(shí)際樣品(滴眼液)的準(zhǔn)確測(cè)定。結(jié)論該法簡(jiǎn)便、快速、抗金屬離子及小分子干擾的能力較強(qiáng)，可用于復(fù)雜實(shí)際樣品中CS的含量測(cè)定。

硫酸軟骨素;熒光分光光度法;酞菁;紅區(qū)熒光探針;含量測(cè)定

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)是從動(dòng)物軟骨中提取的酸性黏多糖。臨床上用作骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的防治藥物，具有抗凝血、抗腫瘤、抗關(guān)節(jié)炎等生理活性，在醫(yī)學(xué)材料、保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越引起人們的重視［1］。對(duì)冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病、骨關(guān)節(jié)炎等也有一定的療效［2-3］。CS常見(jiàn)的測(cè)定方法有高效液相色譜法［4］、比色法［5］、AHMT 分光光度法［6］、離子色譜法［7］、分光光度法［8］、高效毛細(xì)管電泳法［9］等。但上述方法尚存在一些不足之處，如對(duì)儀器和試劑要求較高，操作較為繁瑣，精密度、準(zhǔn)確度、抗干擾能力較低等。四取代三甲基碘化銨金屬酞菁是一類陽(yáng)離子染料，如中心配位元素為反磁性原子，則化合物具有紅區(qū)發(fā)射的熒光特性，可有效避開(kāi)背景熒光和散射光的干擾，且光漂白作用小。酸性條件下，此類化合物帶正電荷，易與帶陰離子基團(tuán)的生物大分子發(fā)生靜電作用而形成離子締合物。本文利用該類化合物的上述特點(diǎn)，以四取代三甲基碘化銨鋁酞菁［Tetra(trimethylammionio)aluminum phthalocynine，TTMAAlPc］為紅區(qū)熒光探針，在酸性介質(zhì)中與CS發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，導(dǎo)致體系熒光強(qiáng)度降低，建立了CS熒光定量分析新方法。

1 材料

TTMAAlPc按文獻(xiàn)［10］方法合成并純化，配制1.0×10－3g/mL 儲(chǔ)備液。

CS(純度95%)，Sigma公司;復(fù)方CS滴眼液，山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司;其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為高純水。

LS-55熒光分光光度計(jì)，美國(guó)PerkinElmer公司;sbs型pH計(jì)，美國(guó)奧立龍公司;Spectra Max M5-多功能酶標(biāo)儀，美國(guó) Molecular Devices公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定方法

0.2 mol/L Britton-Robinson(B-R)系列緩沖液:在濃度均為0.04 mol/L的磷酸、乙酸、硼酸混合液100 mL中加入一定體積的0.2 mol/L NaOH溶液，即得相應(yīng)pH值緩沖液。

1.0 mg/mL CS儲(chǔ)備液，4℃冰箱保存，工作液即用即配。

在5 mL比色管中依次加入適量水、1.0×10－4g/mL TTMAAlPc溶液、1/10體積 pH 5.0的 B-R緩沖液、一定量的CS溶液，用水稀釋至刻度，搖勻后于室溫下靜置反應(yīng)10 min。以試劑空白為參比，用3 mL樣品池在676 nm波長(zhǎng)處測(cè)量不同濃度CS的熒光強(qiáng)度。試劑空白記為If0，含有CS的記為If，熒光強(qiáng)度差 ΔIf=If0－If。

2.2 陽(yáng)離子酞菁的分子結(jié)構(gòu)和光譜特性

TTMAAlPc(圖1)是一種具有類似卟啉結(jié)構(gòu)的強(qiáng)熒光化合物，由于其外周的四個(gè)苯環(huán)上各有一強(qiáng)極性的陽(yáng)離子基團(tuán)，因而在水中的溶解度較大，便于實(shí)際應(yīng)用。TTMAAlPc的熒光發(fā)射峰(676 nm)處于紅區(qū)(圖2)，其激發(fā)帶有兩個(gè)，一個(gè)位于紫外區(qū)稱Soret帶;另一個(gè)位于長(zhǎng)波處，稱Q帶。如采用短波激發(fā)，將在其倍頻處產(chǎn)生很強(qiáng)的二級(jí)散射(散射峰在700 nm左右)，故為避開(kāi)此二級(jí)散射的干擾，激發(fā)波長(zhǎng)選擇在長(zhǎng)波處(610 nm)。加入CS后，TTMAAlPc的熒光發(fā)生猝滅，但峰位置并未改變。陽(yáng)離子金屬酞菁易于與帶有陰離子的生物大分子形成離子締合物而發(fā)生減色效應(yīng)與熒光猝滅現(xiàn)象［11］。CS的分子骨架上帶有酸性基團(tuán)-COOH和-SO3H，在弱酸性介質(zhì)中，TTMAAlPc與荷負(fù)電的CS發(fā)生相互作用而聚集，導(dǎo)致熒光猝滅，本文的方法即是據(jù)此熒光猝滅現(xiàn)象而建立。

圖3為TTMAAlPc與CS復(fù)合物在激發(fā)波長(zhǎng)為610 nm，在650～750 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜圖。在pH 5.0的B-R緩沖液中，陽(yáng)離子酞菁在676 nm左右有最大發(fā)射波長(zhǎng)(圖3曲線1)。加入CS后發(fā)生熒光猝滅，猝滅程度隨CS加入量增大而增大(圖3曲線2～9)。

圖1 TTMAAlPc的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of Tetra(trimethylammionio)aluminum phthalocynine(TTMAAlPc)

圖3 熒光發(fā)射光譜圖Fig.3 Fluorescence emission spectra of TTMAAlPc in the presence of different concentrations of CS

圖2 TTMAAlPc的激發(fā)和發(fā)射波譜圖Fig.2 Emission and excitation spectra of TTMAAlPc

2.3 酸度的影響

在pH 2.2～12.0的范圍內(nèi)，考察了體系pH對(duì)熒光強(qiáng)度變化的影響(圖4)。1.0×10－6g/mL TTMAAlPc加不同pH值B-R緩沖溶液加濃度為1.0 μg/mL的CS溶液，溶液總體積5 mL。可以看出，當(dāng)pH 5.0時(shí) ΔIf值達(dá)到最大，故本文選用 pH 5.0的B-R緩沖溶液，緩沖液用量為反應(yīng)總體積的1/10。

圖4 pH值對(duì)熒光猝滅程度的影響Fig.4 Influence of pH on the degree of fluorescence by CS

2.4 反應(yīng)時(shí)間、溫度和體系的穩(wěn)定性

考察了反應(yīng)時(shí)間和溫度對(duì)結(jié)合反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)的速度較快，室溫下10 min即可達(dá)到平衡，且體系具有較好的穩(wěn)定性，熒光強(qiáng)度值在0.5 h內(nèi)維持恒定。

2.5 熒光探針用量的影響

建立了不同 TTMAAlPc探針濃度(0.5 ×10－6，1.0 ×10－6，2.0 ×10－6，3.0 ×10－6g/mL)下的工作曲線。各濃度線性范圍依次為 0.08～0.8，0.2～1.3，0.6 ～ 2.0，1.5 ～ 6.0 μg/mL。結(jié)果表明，TTMAAlPc濃度為1.0×10－6g/mL時(shí)，工作曲線線性區(qū)間最大，靈敏度亦較好，故選擇TTMAAlPc的最適濃度為1.0 ×10－6g/mL。

2.6 工作曲線

在優(yōu)化條件下，以CS濃度(C，μg/mL)對(duì)ΔIf繪工作曲線，得線性回歸方程為 ΔIf=406.68 C－36.24，r=0.997，線性范圍 0.2 ～ 1.3 μg/mL，檢測(cè)限(3σ)為0.021 μg/mL。

2.7 共存物質(zhì)的影響

分別考察了常見(jiàn)金屬離子、氨基酸等物質(zhì)對(duì)體系的干擾(表1)?？梢钥闯?，上述物質(zhì)的存在對(duì)體系測(cè)定的影響不大，其相對(duì)誤差在±5.0%范圍內(nèi)。干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本法對(duì)上述物質(zhì)的抗干擾能力要優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道。DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子和表面活性劑的對(duì)結(jié)果干擾較大，這可能是由于它們參與對(duì)TTMAAlPc的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合所致。

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

表1 常見(jiàn)干擾物對(duì)CS測(cè)定的影響(CS=1.0μg/mL)Tab.1 Influence of coexisting substances on the determination of CS(CS=1.0 μg/mL)

2.8.1 回收率試驗(yàn) 精密吸取已知濃度的滴眼液溶液20μL，9份，置于9個(gè)10 mL量瓶中，分別加入0.1 mg/mL CS對(duì)照品溶液20，40和60μL各3份，加水稀釋至刻度，按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果分別為 105.1%，100.0%，110.5%，107.1%，107.1%，108.0%，107.3%，107.8% 和106.2%，平均回收率為 106.6%，RSD 為 2.69%(n=9)。

2.8.2 樣品測(cè)定 精密吸取CS滴眼液1 mL，加入丙酮2 mL，并用5 mol/L NaOH溶液2μL調(diào)節(jié)pH，搖勻，至沉淀不再增加，離心，取上清液，按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定。

測(cè)得滴眼液 CS含量為0.14μg/mL，RSD為1.21%(n=9)。

3 討論

本文建立了一種CS熒光定量分析新方法，具有準(zhǔn)確、快速、方便的特點(diǎn)。采用的熒光探針TTMAAlPc是一種陽(yáng)離子酞菁化合物，水溶性好、量子產(chǎn)率高。其熒光發(fā)射位于長(zhǎng)波(紅區(qū))波段，由于在此區(qū)域能發(fā)熒光的天然或合成的物質(zhì)極少，且由于散射光與波長(zhǎng)的四次方成反比，因而，使用TTMAAl-Pc作為分子探針十分有利于避開(kāi)試樣背景熒光及散射光的干擾，從而提高測(cè)定的靈敏度和準(zhǔn)確度。此外，由于可采用長(zhǎng)波(610 nm)激發(fā)，光漂白作用小，有利于體系熒光的穩(wěn)定。

實(shí)際樣品的測(cè)定是本文擬解決的重點(diǎn)問(wèn)題，本文選擇滴眼液為受試樣品，其主要成分為CS、維生素E、維生素B6、尿囊素、牛磺酸，另有輔料玻璃酸鈉、硼酸、硼砂、冰片、薄荷腦、乙醇、吐溫80、三氯叔丁醇等。尤其是其所含的玻璃酸與CS同屬黏多糖，結(jié)構(gòu)具有相似性，實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)CS的測(cè)定存在較為明顯的干擾，因此需對(duì)樣品進(jìn)行前處理以消除干擾。文獻(xiàn)推薦的分離二者的方法有:溶劑分級(jí)沉淀、季銨鹽表面活性劑沉淀、離子交換色譜、凝膠色譜、超濾、電泳［11］。本文采用溶劑分級(jí)沉淀法，這是因?yàn)槿軇┏恋矸ㄅc季銨鹽沉淀較為簡(jiǎn)便，但季銨鹽對(duì)本法有一定干擾，而其余方法步驟較多，不利于實(shí)際應(yīng)用。我們采用丙酮沉淀，并用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，成功地實(shí)現(xiàn)了玻璃酸與CS的沉淀分離，離心后取上清即可進(jìn)行測(cè)定。操作簡(jiǎn)便、快速，具有較好的實(shí)用性，測(cè)定結(jié)果令人滿意。

［1］衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(二部)［S］.第六冊(cè).1998:138-139.

［2］劉 武.硫酸軟骨素藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥業(yè)，2008，17(8):64-66.

［3］陳 磊，凌沛學(xué)，張?zhí)烀?硫酸軟骨素在骨關(guān)節(jié)炎防治中的作用［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2008，29(2):137-139.

［4］Wayne K W，Kathleen G G，Andrew G B.Determination of chondroitin sufate in nutritional supplements by liquid chromatography＆ Related Technologies［J］.J Liq Chrom Rel Technol，2000，23(18):2851-2860.

［5］董 明，曾正宏，陳桂陽(yáng).比色法測(cè)定復(fù)方硫酸軟骨素片中硫酸軟骨素含量［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2002，23(4):191-192.

［6］Kunihiro K，Misako T，Kiyoshi T，et al.Spectrophotometric determination of sodium chondroitin sulfate in eye drops after derivatization with 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1，2，4-triazole［J］.Analyst，1995，120:2755-2758.

［7］茅 力.離子色譜法測(cè)定硫酸軟骨素的含量［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，29(5):358-361.

［8］高貴珍，焦慶才，丁一磊.天青A分光光度法測(cè)定硫酸軟骨素含量的研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2003，23(3):600-602.

［9］沈劍如，陳振德，于榮敏.高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定硫酸軟骨素含量［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2010，31(3):197-199.

［10］ Duan W B，Wang Z X，Cook M J.Synthesis of tetra(trimethylammonio)phthalocyanato zinc tetraiodide，［ZnPc(NMe3)4］I4，and a spectrometric investigation of its interaction with calf thymus DNA［J］.Porphyrin Phthalocyanies，2009，13:1255-1261.

［11］ 凌沛學(xué)，張?zhí)烀?透明質(zhì)酸［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2002:5-8.

Fluorimetric determination of chondroitin sulfate with cationic aluminum phthalocyanine used as a fluorescent probe emitting at red-region

YIN Lu，WANG Jin，HUANG Ping，DENG Ya-bin，LI Dong-hui
(Cancer Research Center，School of Medicine，Xiamen University，Xiamen 361005，China)

Purpose To propose a novel method for quantitative determination of chondroitin sulfate(CS)in practical samples using cationic aluminum phthalocyanine as a fluorescence probe emitting at red-region.Methods It was found that the fluorescence of［Tetra(trimethylammionio)aluminum phthalocyaine］，a cationic red-region fluorescence probe，was extremely quenched by CSin acidic media，because of the formation of association complex between TTMAAlPc and CS.Based on this phenomenon，a new method was developed for quantitative determination of CS.Results Under the optimal conditions(pH 5.0，a reaction time of 10 min，and at room temperature)，the linear range of assay was 0.2-1.3 μg/mL and the detection limit was 0.021 μg/mL.Establishing a solvent precipitation method for sample pre-treatment successfully，we achieve the accurate determination of actual sample(eye drops).Conclu-sion The constructed method is not only accurate but also reliable.It has been used to the analysis of practical samples(eyes-drops)with satisfied results，exhibiting the great potential for practical applications.

chondroitin sulfate;fluorospectrophotometry;phthalocyanine;red-region fluorescence probe;assay

O657.3;R927.3

A

1005-1678(2011)04-0277-04

2011-04-06

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.90206016，20015005)和福建省公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(No.2010R1101)

尹 璐，女，碩士研究生，從事生化分析研究;李東輝，通信作者，Emai:Lidh@xmu.edu.cn。