孟蘭環(huán)，劉興凱，郭軍

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018）

乳及乳制品三聚氰胺殘留HPTLC檢測方法的初步建立

孟蘭環(huán)，劉興凱，郭軍

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018）

以開發(fā)低成本和高通量的三聚氰胺（MA）檢測方法為目的，初步建立用高效薄層色譜（HPTLC）檢測乳及乳制品中三聚氰胺的方法。用高效硅膠G板，以四氫呋喃、水和冰醋酸為展開劑，氯氣和碘-淀粉試劑為顯色劑檢測牛乳中的MA，檢出限可達(dá)5～2.5 mg/L；而用一種初步嘗試的濃縮展開原理，MA檢出限可達(dá)1.0～0.5 mg/L水平。利用HPTLC完全可以建立一類廉價(jià)、操作簡便和高檢測效率的MA殘留檢測方法。

三聚氰胺；薄層層析；牛乳

0 引言

2010年11月國家質(zhì)檢總局頒布了“乳制品和嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)許可條件審查細(xì)則”，其中有條款要求企業(yè)必需自行嚴(yán)格檢測三聚氰胺（Melamine,MA）。然而國家推薦的三種MA檢測方法[1-3]設(shè)備昂貴，維持和耗材費(fèi)用高，實(shí)驗(yàn)室條件要求高，操作復(fù)雜耗時(shí)。企業(yè)為滿足高通量、快速檢測需要，還采用昂貴的進(jìn)口免疫標(biāo)記試劑盒。2009年以來我們嘗試用高效薄層色譜（High Performance Thin Layer Charamotograph，HPTLC）法檢測牛乳中污染的MA，檢出限可達(dá)5.0 mg/L水平（圖1）。可喜的是經(jīng)過展開原理的創(chuàng)新性改進(jìn)（樣品在展開過程中被濃縮），檢出限可達(dá)1.0 mg/L，甚至達(dá)0.5 mg/L水平（圖2），但可重復(fù)性和穩(wěn)定性有待進(jìn)一步研究提高。現(xiàn)將成熟的部分簡報(bào)如下。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

普通硅膠G60層析板（自制）[4]，預(yù)制高效硅膠G板（批次：2010年8月，規(guī)格100 mm×100 mm和100 mm× 150 mm），四氫呋喃、冰醋酸、高錳酸鉀、鹽酸、可溶性淀粉、碘化鉀均為分析純。三聚氰胺（MA）標(biāo)準(zhǔn)品，純度99%，進(jìn)口分裝。

SB-3型薄層色譜噴霧泵。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)MA牛乳制備

準(zhǔn)確稱取0.01 g三聚氰胺，用無MA牛乳溶解定容至100 mL，相當(dāng)于含100 mg/L的三聚氰胺牛乳溶液，再用無MA牛乳制備100 mg/L至0.5 mg/L的MA標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度系列，點(diǎn)樣時(shí)用蒸餾水做1:1稀釋。見表1。

1.2.2 氯氣的制備

按無機(jī)化學(xué)氯氣制備原理和反應(yīng)式制備。稱取3 g高錳酸鉀和5 mL濃鹽酸在氯氣制備器中混合，制得1 L氯氣，通入密閉容器保存。

1.2.30.5%淀粉碘化鉀溶液的制備

稱取可溶性淀粉0.5 g加入至100 mL溫度為80～90℃的蒸餾水中，煮沸至完全透明，冷卻至室溫，加入0.5 g KI溶解，過濾，避光冷藏保存[5]。

1.2.4 點(diǎn)樣

將MA標(biāo)準(zhǔn)牛乳溶液和指控樣品牛乳用蒸餾水做1︰1稀釋（體積比）。然后在距薄層板底邊1.0 cm處手工點(diǎn)狀點(diǎn)樣2.0 μL，點(diǎn)間距為10 mm。100×100 mm薄層板可點(diǎn)9個(gè)乳樣，100×150 mm可點(diǎn)14個(gè)乳樣，100× 200 mm可點(diǎn)19個(gè)乳樣。

1.2.5 展開

基本展開劑為四氫呋喃︰水（9.5︰0.5，體積比）、四氫呋喃︰水︰冰醋酸（9.5︰0.25︰0.25,體積比），另外初試了一種創(chuàng)新性原理的“濃縮展開劑”。均上行展開，無需飽和，展開劑距原點(diǎn)0.5 cm，展距7 cm，展開時(shí)間均約10 min。

1.2.6 顯色

將展開后的薄層板在空氣中晾干，置于充滿氯氣的密閉容器中5 min，取出，通風(fēng)放置5 min揮發(fā)氯氣，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%淀粉碘化鉀溶液噴霧顯色后目視觀察結(jié)果。在背景光下觀察結(jié)果更明顯。

2 結(jié)果

結(jié)果如表1，圖1和圖2所示。普通層析板上檢出限在50～40 mg/L左右；本次使用的國產(chǎn)高效層析板用常規(guī)展開原理檢出限可達(dá)30～20 mg/L，使用本研究創(chuàng)新的濃縮展開原理后，檢出限可達(dá)5.0～2.5 mg/L。而初步優(yōu)化的濃縮展開劑，可使薄層層析檢出限達(dá)1.0 mg/L，甚

圖2中，1，2，4，6，8，10，12道MA質(zhì)量濃度分別為10，8.0，6.0，4.0，2.0，1.0，0.5 mg/L；3，5，7，9，11道為被檢乳樣，MA質(zhì)量濃度約2.5 mg/L。至0.5 mg/L。用四氫呋喃和蒸餾水為展開劑，容易出現(xiàn)Rf值與MA接近的干擾物質(zhì)，而用冰醋酸酸化的展開劑和濃縮展開劑則對(duì)MA的分離效果增強(qiáng)。在本實(shí)驗(yàn)使用的高效層析板，MA的Rf值為0.5，不同濃度樣品的Rf值一致，沒有干擾物質(zhì)。采用濃縮展開原理，展開中MA被濃縮，因此斑點(diǎn)呈橢圓型（圖1）、弦月形或線形（圖2），檢出限大大提高。

一個(gè)薄層板操作時(shí)間30～60 min，一個(gè)100×100 mm的小型薄層板可檢測5～9個(gè)乳樣，而100×150 mm或100×200 mm的薄層板可檢測14～19個(gè)樣品，則一個(gè)乳樣平均檢測時(shí)間僅為數(shù)分鐘。顯然HPTLC檢測效率很高，適合大批量乳樣的MA檢測。

3 討論

表1 標(biāo)準(zhǔn)MA牛乳濃度和HPTLC檢測結(jié)果

圖1中，從左至右MA質(zhì)量濃度為0，50，40，30，20，10，5，2.5 mg/L。使用了樣品斑點(diǎn)濃縮技術(shù)。

目前國際上推薦使用和報(bào)道的MA檢測方法較多，但除了本研究外僅檢索一篇Melanie Broszat等用TLC建立MA定量檢測方法的報(bào)道，但展開劑與本研究完全不同，檢出限也僅為30 mg/kg水平[6]。TLC在色譜家族使用范圍最寬，因此被譽(yù)為“萬能色譜法”，但相對(duì)其他后來發(fā)展的色譜方法，TLC靈敏度低、在接近檢測極限時(shí)重復(fù)性、穩(wěn)定性較差。這可能也是眾多開發(fā)者沒有選擇TLC來建立MA檢測方法的原因。本研究組在2009年初獨(dú)立研究建立了TLC檢測MA方法，但因檢出限與2008年國家臨時(shí)制定的MA監(jiān)控限量（2.5～1.0 mg/kg）[7]差距太大而未作報(bào)道，并一度中斷研究實(shí)驗(yàn)。隨著對(duì)“現(xiàn)代薄層層析法”和“高效薄層層析（HPTLC）”潛能認(rèn)識(shí)的加深，我們重新調(diào)整思路，在大量實(shí)驗(yàn)中找到了一種提高TLC法檢測MA靈敏度的關(guān)鍵原理——濃縮展開原理，并獲得了初步實(shí)效。但眾所周知，薄層板材料、型號(hào)和展開劑理化性質(zhì)的變化以及這兩者的交互作用變化十分敏感，因此本研究建立的方法在穩(wěn)定性、重復(fù)性方面仍需做較多的實(shí)驗(yàn)，并完善MA的HPTLC定量分析方案。后續(xù)研究將另行報(bào)道。

本研究證明，HPTLC檢測MA是完全可行的，而且靈敏度還有望優(yōu)化提高。與目前國家推薦的3種方法[1-3]相比，用該方法進(jìn)行定性或半定量檢測無需特殊儀器、樣品前處理簡單，檢測效率高，無疑會(huì)成為一種高通量、檢測成本低廉的MA檢測方法,尤其適合在企業(yè)進(jìn)行大批量原奶、奶粉及其他原料、輔料和添加劑的高通量檢驗(yàn)和篩選檢驗(yàn)，適合監(jiān)控意外嚴(yán)重污染的突發(fā)。

[1]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn).GB/T 22388-2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[2]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn).GB/T 22400-2008原料乳中三聚氰胺快速檢測液相色譜法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[3]中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).NY/T 1372-2007飼料中三聚氰胺的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[4]何麗一.平面色譜方法及應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社.2005：29.

[5]侯曼玲.食品分析[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：211.

[6]MELANIE B,REGINA B,BERND S.A New Method for Quantification of Melamine in Milk by Absorption Diode-Array Thin-Layer Chromatography[J].Journal of Planar Chromatography，2008,21(6): 469-470.

[7]中華人民共和國衛(wèi)生部2008年10月08日.衛(wèi)生部發(fā)布會(huì)介紹三聚氰胺臨時(shí)管理限量值規(guī)定等[N/OL].中央政府門戶網(wǎng)站.http://www. gov.cn/xwfb/2008-10/08/content_1115170.htm.

Preliminary establishment of a high sensitivity melamine determination method by HPTLC

MENG Lan-huan,LIU Xing-kai,GUO Jun
（Food Science and Engineering College of Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China）

To develop low-cost and high throughput method for melamine(MA)determination in milk and dairy product,a sensitive high performance thin layer chromatographic(HPTLC)method was initially established.MA concentrated during developing on plate.On a high performance silica gel G plate(domestic product),with tetrahydrofuran,water and acetic acid as the basic developing agent,Chlorine and iodine/starch reagent applied as staining reagent,the detection limit reached 5.0～2.5 mg/L,even reached 1.0～0.5 mg/L level in optimized experiment.Obviously HPTLC can be use to build an inexpensive,easy operating and high efficient MA residues detection.

Melamine,HPTLC,milk

TS252.7

A

1001-2230（2011）06-0060-02

2011-03-01

孟蘭環(huán)（1984-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。通訊作者：郭軍