李運飛，付緒梅，彭澤萍，孟潔，周衣來，卜林

（1.六安初創(chuàng)人乳庫有限公司，安徽六安 237000；2.六安市金安區(qū)婦幼保健院，安徽六安 237000）

蛋白質分析技術在牛乳和人乳鑒別方面的應用

李運飛1，付緒梅2，彭澤萍2，孟潔1，周衣來1，卜林1

（1.六安初創(chuàng)人乳庫有限公司，安徽六安 237000；2.六安市金安區(qū)婦幼保健院，安徽六安 237000）

概要歸納了人乳、牛乳和大豆中的主要蛋白質在質量分數(shù)和特性上的差別，綜述了將電泳、色譜、質譜、光譜和免疫組化等蛋白質定量、定性分析技術應用于各類蛋白的分離、鑒定和純度檢測的文獻報道，比較了各種檢測方法的優(yōu)缺點，認為變性凝膠電泳技術因其操作簡便和成本低廉更適用于人乳產業(yè)化初期的原料乳純度檢測。

人乳；蛋白質分析技術；組分鑒別；純度檢測

0 引言

人乳庫在采集母乳時，會對捐乳產婦進行必要的營養(yǎng)補償。一部分產婦往往會受各種因素的驅使，摻入其他類乳物質（如牛乳、奶粉、豆粉等），從而給原料乳帶來質量和安全隱患。因此必須對采集的乳汁進行純度測定。常規(guī)的理化檢測[1]，會因捐乳產婦的體質、飲食、生產方式等而使各參數(shù)出現(xiàn)較大范圍的波動[2]，難以應用。而利用人乳中主要蛋白質的生物學特性，通過各種分析技術，將不同樣品之間特征圖譜或特征反應的差異作為純度鑒定的直接依據，卻是一種可靠性高、重復性好的方法。

本文全面回顧了采用電泳、色譜、質譜、光譜和免疫組化技術研究人乳和牛乳主要蛋白質的文獻，重點關注了鑒別牛乳和人乳中異源蛋白從而判斷乳樣純度的報道；從中比較各方法在分辨率、檢測限、檢測速度、操作難易上的差異，為深入探尋可行的產業(yè)化人乳純度鑒別手段提供思路。

1 差異分析基礎——乳蛋白的種類與質量分數(shù)

人乳與牛乳以及大豆中的主要蛋白成分在質量分數(shù)[3]、分子量和等電點上均有較大差異，這些都成為各種檢測技術的分析基礎。如表1和表2所示。

表1中，a為泌乳30 d后的常乳；b為β-乳球蛋白單體分子量，其常以二聚體形式存在；c為免疫球蛋白A二聚體的分子量。在強還原劑的作用下可分解為4條重鏈（分子量約50 000 u）、4條輕鏈（分子量約25 000 u）、1條分泌片（分子量約78 000 u）和1條J鏈（分子量約15 000 u）；d為免疫球蛋白G單體的分子量，包括2條重鏈（分子量約55 000 u）和2條輕鏈（分子量約25 000 u）。

2 蛋白質電泳技術

近年來，電泳已成為蛋白質鑒別與定量檢測時最常采用的技術。一般可以分為變性凝膠電泳（SDSPAGE）、等電聚焦電泳（IEF）、二維電泳（2-DE）和毛細管電泳（CE）等。

2.1 變性凝膠電泳（SDS-PAGE）

在SDS-PAGE中，不同分子量的高豐度乳蛋白均可以在電泳圖譜上顯現(xiàn)。根據蛋白條帶的位置和灰度，并結合標準品的圖譜，可以判斷出蛋白種類，進而可推測乳樣的純度。

表1 人乳、牛乳中主要蛋白質的生物學特性

表2 大豆中主要蛋白質的生物學特性

SDS-PAGE最初被用于牛乳中酪蛋白的分離鑒別，獲得了αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白和γ-酪蛋白的3個亞基，以及β-乳球蛋白、α-乳白蛋白的電泳圖譜。此后，徐麗、張杉、張春剛和韓奕奕等人[4-7]分別對新鮮脫脂牛初乳液、乳清蛋白濃縮粉、牛初乳乳清、牛常乳乳清、免疫牛乳乳清等進行了SDS-PAGE，相繼得到了IgG重鏈、乳鐵蛋白、血清白蛋白等蛋白圖譜。黃慧華等[8]觀察了不同處理條件下大豆蛋白的電泳圖譜，其中大豆分離蛋白呈現(xiàn)出12條帶，大豆水浸提液獲得17條帶。這些蛋白圖譜所傳達出的蛋白分子量和質量分數(shù)信息與文獻報道呈現(xiàn)出較好的一致性，成為日后鑒別人乳純度的有力依據。

Hewedy M.M[9]較早地將SDS-PAGE用于牛乳中異類蛋白的檢測。他對比了摻入豆乳的牛乳SDSPAGE圖譜，發(fā)現(xiàn)質量分數(shù)為5%的豆乳添加量即可在圖譜上顯示出與純牛乳明顯的差異。趙慧芬[10]對牛乳、豆奶和二者混合物進行電泳，得到了7條牛乳蛋白帶和13條豆奶蛋白帶，并且通過顏色最深的豆奶蛋白帶推算出牛乳中摻入的豆奶最低檢測限為5%。高巍[11]也對新鮮脫脂牛乳、羊奶、豆粉溶解液的電泳圖譜差異進行了研究。結果顯示，3種乳樣的蛋白條帶呈現(xiàn)出明顯差異，其中牛乳與羊乳在低分子量區(qū)域的蛋白條帶較為相似，但中高分子量則差異較大；而豆乳在整個區(qū)域內的蛋白條帶均與牛乳和羊乳有顯著區(qū)別。

在使用SDS-PAGE研究人乳蛋白的文獻中，王靜等人[12]對母乳進行免疫親和層析，并用SDS-PAGE檢驗免疫前后母乳中高豐度蛋白的質量分數(shù)，得到了6條清晰的蛋白條帶（乳鐵蛋白、血清白蛋白、IgA的重鏈和輕鏈、酪蛋白以及被疑為血清白蛋白碎片的蛋白）。David J.Palmer等人[13]在研究脫脂人初乳中的微量蛋白時，用SDS-PAGE檢測脫除高豐度蛋白的效果，在脫除前的初乳電泳圖譜上也觀察到了乳鐵蛋白+IgA的分泌片、血清白蛋白+IgA的重鏈、IgA輕鏈、I-gA的J鏈以及α-乳白蛋白共5條帶。Mary Boesman-Finkelstein等人[14]對脫脂脫酪蛋白的人乳乳清液進行了SDS-PAGE，得到了乳鐵蛋白、血清白蛋白、IgA重鏈、IgA輕鏈、溶菌酶以及分子量約30000和20000的蛋白共7條帶。Ronayne de Ferrer P.A.等人[15]在研究南象海豹初乳汁成分時，使用了人乳和牛乳作為對照，在SDS-PAGE中獲得了5條人乳和4條牛乳的蛋白條帶。

2.2 等電聚焦電泳（IEF）

IEF始于20世紀60年代。因其pH值可以達到0.02～0.001的分辨率，遠優(yōu)于SDSPAGE的分離與鑒別效果，因此也成為研究乳蛋白的有力工具。

Peterson[16]于1969年最早使用了IEF技術分析牛乳酪蛋白，獲得了20條酪蛋白帶。此后，IEF技術被廣泛應用于κ-酪蛋白A型與B型的鑒別、全牛乳蛋白的分析以及對牛乳乳清蛋白和酪蛋白中遺傳變異特性的分析中。

至今尚未見到利用單獨的IEF技術研究人乳蛋白的報道，原因在于IEF與SDS-PAGE結合，可以發(fā)展成更高分辨率的電泳技術—2-DE。

2.3 二維電泳（2-DE）

2-DE充分利用了蛋白質分子在等電點與亞基分子量上的二相差異，在IEF后將泳道旋轉90度，在第二維方向上繼續(xù)SDS-PAGE，可以獲得分辨率極高的蛋白點。因此，盡管2-DE技術問世只有30多年，但已被認為是當前分辨率最高、信息量最大的電泳技術，廣泛使用于乳蛋白質組學的研究中。

2-DE最早于1981年被用于牛乳酪蛋白的分析上。此后數(shù)年中，又分別被用到牛乳清蛋白和脫脂牛乳的研究中。Yamada M.等人[17]應用2-DE結合微陣列和質譜分析，鑒定牛初乳和常乳中低豐度蛋白的表達差異。圖譜表明：IgG的重鏈與輕鏈以及β-酪蛋白在牛初乳與牛常乳中的含量有較大差異，而α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的質量分數(shù)較穩(wěn)定。此外，在牛初乳的2-DE圖譜上還發(fā)現(xiàn)了至少6個低豐度蛋白點，在牛常乳中未見。

在人乳研究方面，Kouki Murakami等人[18]利用2-DE技術詳細研究了人初乳與人常乳乳清中微量蛋白的差異。用免疫親和層析去除乳清中的絕大部分乳鐵蛋白、α-乳白蛋白和sIgA后，對剩余的微量乳清蛋白進行分析，得到了約400個蛋白點。對其中較為清晰的28個點進行氨基酸序列分析，并檢索蛋白質數(shù)據庫，根據序列契合程度確認了其中的22種蛋白質，包括αS1-酪蛋白和β-酪蛋白、溶菌酶、血清白蛋白、轉鐵蛋白和sIgA的重鏈及輕鏈等。Kim H.Y.和Jemenez-Flores R.[19]深入研究了5種哺乳動物（人、牛、山羊、豬和鼠）乳汁蛋白在2-DE下的圖譜差異。他們認為人、豬和鼠的蛋白斑點分布與牛和山羊的差別較大，可能源于食性的根本不同。Anderson N.G.等人[20]對全人乳（指包含酪蛋白和乳清蛋白）和人乳清進行2-DE后，識別出主要的人乳蛋白，包括14個酪蛋白點（9個翻譯后修飾的β-酪蛋白和5個α-酪蛋白）、α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、血清白蛋白和轉鐵蛋白；Goldfarb M.等人[21]對脫脂人乳進行2-DE后獲得34個蛋白點，涵蓋了I-gA、酪蛋白、乳鐵蛋白、血清白蛋白、α-乳白蛋白和溶菌酶。

以2-DE為基礎的多種分析手段的聯(lián)合使用不僅大大提升了人們認識乳蛋白的能力，也使得從更高精度和更微量水平上分析異種乳蛋白間的差異成為可能。如Goldfarb M.等人[22，23]在1997年進行完2-DE后用選擇性抗體識別出多種人乳脂肪球膜蛋白；在其1999年的研究中又使用了酪蛋白單克隆抗體和計算機成像技術分析出人乳中酪蛋白的細微組分和質量分數(shù)。2-DE結合特異性抗體的免疫印記技術研究人乳中的微量蛋白（如巨噬細胞轉移抑制因子）也獲得成功。

2.4 毛細管電泳（CE）

CE利用了細管徑（500～5 μm）帶來的熱效應低、進樣量少、流動速度快和高分辨率等優(yōu)點，迅速成為與2-DE技術一樣的乳蛋白質組學研究的有力工具。

國內外將CE技術用于牛乳制品摻雜檢測的研究已經有多篇報道。Isidra Recio等人[24]綜述了用CE檢測牛乳中各蛋白的多態(tài)性、熱處理對蛋白構象的影響以及如何檢測摻假物質。Jesús López-Tapia等人[25]研究了在脫脂奶粉中添加不同量（從0至44%）大豆?jié)饪s蛋白和大豆分離蛋白時的CE圖譜，結果奶粉中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和α-酪蛋白；大豆中的α-伴大豆球蛋白（2S）、大豆球蛋白（11S）中的酸性亞基、β-伴大豆球蛋白（11S）中的β-亞基以及α-和α’-亞基4條峰均隨著添加量的變化呈現(xiàn)出“此消彼長”的變化趨勢。劉婷[26]進行了類似研究。在CE圖譜中，可見牛乳中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白；以及大豆中的8條蛋白吸收峰，并且峰形位置和峰值不隨乳樣品種而變化。她最終根據牛乳酪蛋白峰的積分面積與大豆蛋白峰積分面積的比值估算出摻入大豆蛋白的比例。張智武[27]在對比SDS-PAGE、CGE（毛細管凝膠電泳）和CZE（毛細管區(qū)帶電泳）分離鑒別脫脂牛乳蛋白的效果時，在最優(yōu)的CZE圖譜上也觀察到上述5條帶。Isidra Recio等人[28]研究了UHT牛乳中摻入牛皺胃酶凝乳清固體的檢測方法。此外，鮮牛乳和不同階段嬰幼兒奶粉在CE下的吸收峰圖譜、不同物種（牛、綿羊和山羊）間乳的CE圖譜以及對牛乳不同處理方式（原料牛乳、巴氏殺菌乳核UHT乳）下乳清蛋白對總蛋白比率（通過CE吸收峰面積累加計算）的差異也被深入研究，均被認為可以作為牛乳中異源蛋白（包括非鮮乳）檢測的備選方法。

Manso M.A.等人[31]利用毛細管區(qū)帶電泳（CZE）進行了開創(chuàng)性的人乳與牛乳的鑒別比較研究。他分析了不同泌乳階段下脫脂人乳中主要蛋白的電泳圖譜，同時以UHT（超高溫瞬時滅菌）牛乳做為對照，結果在3周時的人乳中出現(xiàn)了溶菌酶、乳鐵蛋白的峰形，而牛乳則沒有；牛乳特有的β-乳球蛋白在人乳中也沒有出現(xiàn)。并且α-乳白蛋白、β-酪蛋白的峰高；以及α-酪蛋白的峰位置在人乳和牛乳間也有明顯差異。該報道還進一步歸納了從0至17周的各段人乳中乳清蛋白對酪蛋白的比例以及β-酪蛋白的6種磷酸化異構體的相對質量分數(shù)（均由峰面積計算得出），為區(qū)分鑒別人乳與牛乳、人初乳和人常乳提供了重要依據。

3 液相色譜技術

HPLC具有特異性強、靈敏度高、速度快、對蛋白質變性不敏感等諸多優(yōu)點，被許多研究者用于乳蛋白分離鑒定和純度鑒別中。

HPLC技術可以輕松實現(xiàn)對乳蛋白中各種成分乃至遺傳變異體的分離。如Hollar C.M.等人[30]通過離子交換快速蛋白質液相色譜（CE-FPLC）從牛乳酪蛋白分離出αS1-、αS2-、β-、κ-和γ-5種亞型。Bordin G.等人[31]使用離子束反相HPLC從UHT乳、巴氏殺菌乳、乳粉和鮮牛乳中分離出αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，α-乳白蛋白，以及β-乳球蛋白的A型和B型。王浩等人（2009）[32]和王娟等人（2009）[33]也獲得過相近的分離結果。

在異類乳蛋白檢測方面，HPLC得到了充分發(fā)揮，利用不同的特征指示物反映出各種異源蛋白的摻加程度。如通過對比水解動物蛋白與乳粉的氨基酸指紋圖譜，確定出甘氨酸、丙氨酸等差異顯著的6種特征氨基酸，從而建立一種對乳粉中摻加的水解動物蛋白的半定量檢測方法。通過檢測牛乳中羥脯氨酸的含量，間接反映出乳中摻加的膠原水解蛋白的量，可獲得質量濃度為2.5 mg/L的檢出限。通過檢測γ-和κ-酪蛋白以及β-乳球蛋白的含量，推算奶酪中牛乳、綿羊乳和山羊乳的百分比，從而判斷奶酪的摻假情況。Jerzy Dziuba等人[34]在將混雜了牛乳蛋白的大豆分離蛋白用胰蛋白酶水解后，通過HPLC觀測到兩類乳蛋白水解物中游離氨基酸的特征峰，可以判斷出5%的牛乳摻加量。

單純利用HPLC技術研究人乳蛋白的文獻少有報道。而以HPLC作為分離手段，以MS、光譜或免疫組化技術作為鑒定手段的報道卻屢見不鮮。

4 生物質譜技術

生物質譜技術興起于20世紀80年代末。由于具有檢測靈敏度高，質量范圍寬，分析速度快，樣品用量少和性能可靠等優(yōu)點，所以很快就成為復雜生物體系中多肽與蛋白質分析鑒定的首選工具。目前被廣泛用于蛋白質組學研究的質譜技術包括電噴霧質譜（ESIMS）、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDITOF-MS）和傅里葉變換離子回旋共振質譜（FT-ICR-MS）。此外，將HPLC與MS結合使用的報道也屢見不鮮。

早期的質譜技術被用于研究奶牛乳汁的蛋白成分。隨后，又相繼被用于研究嬰兒配方奶粉中蛋白質的構成、綿羊乳中主要蛋白及其變異體、山羊乳蛋白和牛乳乳清蛋白。

與HPLC一樣，MS應用于乳樣中異類蛋白檢測時，也根據特征標志物進行判斷。如根據大豆球蛋白，β-伴大豆球蛋白和豌豆球蛋白被胰蛋白酶水解后的多肽含量，判斷脫脂牛乳粉中摻加的大豆或豌豆蛋白，可估算出最低1%的添加量。以α-乳白蛋白和β-乳球蛋白作為標志物，推測出綿羊乳、山羊乳和水牛乳中添加的牛乳比例，以及在原料牛乳中摻加的乳粉，檢測限均可達到5%。Kristian Hovde Liland等人[35]對應用于牛乳、山羊和綿羊乳鑒別檢測的MALDI-TOF-MS技術，從參數(shù)優(yōu)化到準確度分析進行了詳細的討論。

利用MS技術對人乳進行的研究雖然仍未涉及到檢測其中的異類蛋白，但對各種人乳蛋白及其異構體的精準分析，仍讓我們看到了它所具有的巨大潛力。Silvia Catinella等人[36]利用MALDI-TOF-MS技術研究了脫脂后的人初乳、人常乳的質譜圖，發(fā)現(xiàn)隨著泌乳期的延長，乳鐵蛋白、sIgA的重鏈呈遞減趨勢，α-乳白蛋白、溶菌酶、β-酪蛋白和κ-酪蛋白則逐漸增多，而血清白蛋白基本保持恒定。Gianluca Picariello等人[37]用親水相互作用色譜（HILIC）結合MALDI-TOF-MS分析脫脂人乳中的N-交聯(lián)糖蛋白，在質譜圖上可以分辨出αS1-酪蛋白的2種異構體、β-酪蛋白的4種異構體、κ-酪蛋白以及乳鐵蛋白的3種異構體。石磊等人[38]利用FT-ICR-MS技術分析了經過脫脂和酶解的人乳乳脂、乳清和乳粒中的蛋白成分，其中在乳清部分獲得了乳鐵蛋白、α-乳白蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、αS1-酪蛋白剪接亞型2和免疫球蛋白多聚體受體的質譜信息；在乳粒部分獲得了乳鐵蛋白、αS1-酪蛋白剪接亞型2、免疫球蛋白多聚體受體和溶菌酶C的質譜信息。John W.Froehlich等人[39]應用無標記液相色譜串聯(lián)質譜法（Label-free liquid chromatography–tandem mass spectrometry）分析了人乳中蛋白磷酸化的動力學特征，其中α-酪蛋白、β-酪蛋白和免疫球蛋白多聚體受體的各磷酸化異構體均得到定量。

5 近紅外光譜技術

近紅外光譜具有分析速度快、精度高、成本低，不產生化學污染，儀器操作和維護簡單等優(yōu)點，以它為基礎開發(fā)出的牛乳成分自動分析儀已在國內乳品行業(yè)中得到廣泛應用。因此國內的研究報道普遍聚焦于近紅外光譜技術對牛乳成分的全面分析，通過對牛乳蛋白、脂肪、乳糖各類物質中的含氫基團的振動圖譜來推斷其中是否摻有外來物質，如韓東海等人[40]通過光譜分析可以判斷出生鮮牛乳中摻入的10%的還原乳，正確率達96.7%；李亮等人[41]應用主成分分析法得到能反映牛乳99.32%紅外光譜信息的6個主成分，由這些成分的得分圖可以區(qū)分摻羊奶和豆?jié){的牛乳，鑒別正確率在95%以上。

國外學者將光譜技術用于檢測動物乳樣中異類蛋白的報道也有數(shù)篇，如Beatriz Miralles等人[42]使用四階導數(shù)光譜技術測定了UHT滅菌乳中乳清蛋白對總蛋白的比率，可以推算出UHT乳中摻加的最少5%的乳清蛋白。I.González-Martín等人[43]用遠程反射光纖探頭獲取不同成熟期奶酪中各成分的近紅外光譜數(shù)據，從中可以分析出牛乳、綿羊乳和山羊乳的添加比例。N.Nicolaou等人[46]利用傅里葉轉換紅外光譜（FT-IR）技術分析牛乳、綿羊乳和山羊乳的任意二相或三相混合物，可以測定出質量分數(shù)為5%的任何一種乳。目前尚無應用紅外光譜技術分析人乳成分的文獻報道。

6 免疫組織化學技術

免疫組織化學技術按照標記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自顯影法等。目前采用較多的是免疫酶法，又稱酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。由于酶的高催化效率，間接放大了反應結果，故可以達到很高的靈敏度。

免疫組化做為一種快速且準確度較高的蛋白質分析手段，已被多位研究者用于各類乳蛋白的定量檢測上。如對牛乳制品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、αS-酪蛋白和κ-酪蛋白的定量研究；對牛乳β-酪蛋白、κ-酪蛋白的檢測；對牛初乳中乳鐵蛋白的檢測；以及對人初乳與成熟乳中的分泌型IgA的檢測等。

在研究乳樣中異類蛋白的檢測方面，國外學者較多研究了綿羊乳、山羊乳和牛乳的鑒別方法。按照制備的抗體種類，可以分為①兔抗乳蛋白抗體，如Teresa García等人[45]和Elena Rodríguez等人[46]采用的兔抗牛乳清蛋白抗體和抗牛酪蛋白抗體；ERODRíGUEZ等人[47]采用的兔抗山羊酪蛋白單克隆抗體。②雞抗乳蛋白抗體，如Manfred Beer等人[48]和Wolfgang Richter等人[49]采用的雞抗牛β-乳球蛋白抗體、雞抗牛γ3-酪蛋白抗體。③鼠抗乳蛋白抗體，如I.P.Hurley等人[50]采用的交聯(lián)過氧化物酶的鼠抗牛IgG抗體。④反芻動物間的乳蛋白抗體，如P.Aranda等人[51]采用的交聯(lián)過氧化物酶的山羊抗綿羊免疫球蛋白抗體；Ian P.Hurley等人[52]采用的連接山羊抗牛IgG多克隆抗體的單克隆抗體。

此外，免疫組化技術也被直接用在牛乳中摻雜的豆乳；奶酪中摻加的巴氏殺菌乳、UHT滅菌乳或熱變性乳清粉以及脫脂乳粉和酪乳粉中摻加的牛皺胃酶凝乳清粉的檢測上。E Bertino等人[53]在研究母親膳食中牛乳攝入量對乳汁成分的影響時，用ELISA法測定出牛β-乳球蛋白含量；并且在將抗原抗體復合物分開后，識別出了母乳中的乳鐵蛋白、β-酪蛋白和α-乳白蛋白。此結果也為免疫組化技術用于人乳純度鑒別提供了最直接的依據。

免疫化學與其他分析手段結合產生的新方法也逐漸被應用到乳中異類蛋白的檢測中。Carmen Martín-Hernández等人[54]利用側流免疫層析試紙條測試（immunochromatographic lateral-flow test dipstick test）技術檢測了脫脂牛乳粉、鮮牛乳、巴氏殺菌乳和UHT乳中的乳清摻加量。通過兩種特異性抗牛κ-酪蛋白單克隆抗體與牛酪蛋白糖巨肽的結合，最低可以觀察到4%的乳清存在。Harvey E.Indyk[55]應用近幾年才出現(xiàn)的無標記型免疫傳感技術，用表面等離子共振傳感器測定了牛乳中抗牛α-乳白蛋白抗體含量，檢測限為0.12 g/L。這些研究都為免疫組化技術分析乳蛋白領域注入了新動力。

7 結束語

總體上看，SDS-PAGE、2-DE和MS對人乳蛋白的研究相對較多，尤其是2-DE，其研究的深度與廣度對我們在高分辨率和微觀量上探討適合產業(yè)化的原料乳純度檢測技術大有裨益。而在涉及牛乳與異類蛋白差異方面，CE、HPLC、MS和免疫組化技術無疑走得更遠一些。直接研究人乳中異類蛋白檢測的文獻尚無報道，這也成為人乳產業(yè)化中需盡全力攻克原乳純度檢測難題的動力之一。

SDS-PAGE雖然分辨率并不高，但由于操作簡便，對儀器設備要求不高，而日益成為分離、定量乳蛋白質的基礎技術，也多作為預分離手段廣泛用于2-DE，CE，HPLC，MS和免疫分析中。2-DE技術具有高通量、高分辨率的特點，但其對蛋白點圖像處理的繁瑣與費時限制了它用于原料乳純度檢測的范圍。HPLC和MS一般被聯(lián)合使用，將HPLC對復雜樣品的高分離能力與MS的高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質量與結構信息的優(yōu)點結合起來，更多的用于檢測乳樣中的農殘、藥殘。HPLC和MS設備昂貴，對使用者有較高要求，限制了技術的普及。以ELISA為代表的免疫組化技術需要制備高純度的乳蛋白克隆抗體，操作繁瑣，且多針對幾類假想的摻假物質，應用面窄。紅外光譜技術需要建立穩(wěn)定性和可靠性強的模型，對建模人員的經驗要求較高；此外乳樣中水分、各類物質的存在形式（如真溶液、膠體溶液、乳濁液等）也會干擾紅外光的穿透，造成散射影響結果的準確。

人乳男，生理醫(yī)學博士，從事生長激素和綜合考慮各種技術的優(yōu)缺點，CE具有高檢測精度和較快的檢測速度，但儀器設備昂貴，操作復雜。對于處在初創(chuàng)期的生產型企業(yè)來說，SDS-PAGE技術具有更為現(xiàn)實的性價比，并且易于普及推廣。

[1]龐廣昌，陳慶森，胡志和，等.乳品安全性和乳品檢測技術[M].北京：科學出版社，2005.

[2]ROBERT G J.Miscellaneous Factors Affecting Composition and Volume of Human and Bovine Milks[M].San Diego,USA:Academic Press,1995:237-271.

[3]GUO Mingruo,GREGORY H M.Chemistry and Biological Properties of Human Milk[J].Current Nutrition&Food Science,2008,4(4): 305-320

[4]徐麗.牛初乳中免疫球蛋白的提取與活性保持技術研究[D].北京：中國農業(yè)大學，2005.

[5]張杉，陳敏，李慧.SDS-PAGE電泳測定乳清蛋白方法的研究[J].食品科技，2008（1）：215-219.

[6]張春剛，王加啟，劉光磊，等.牛初乳、常乳和免疫乳乳清中主要蛋白的SDS-PAGE分析[J].揚州大學學報(農業(yè)與生命科學版)，2008,29（2）：43-47.

[7]韓奕奕，黃菲菲，王建軍，等.凝膠電泳法(SDS-PAGE)測定乳與乳制品中β-乳球蛋白的含量[J].乳業(yè)科學與技術，2009,32（2）：74-77.

[8]黃惠華，高孔榮，郭乾初，等.大豆原料及其分離蛋白的SDS-PAGE圖譜研究[J].食品科學，2000,21（6）：15-19.

[9]HEWEDY M M,SMITH C J.Detection of SOY milk in pasteurized bovine milk[J].Food Hydrocolloids,1989,3(5):399-405.

[10]趙慧芬.十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）檢測牛奶中摻雜的豆奶[J].食品科學，1996,17（11）：50-53.

[11]高巍，孫慶林，王鵬.聚丙烯酰胺凝膠電泳快速鑒定牛乳蛋白質的研究[J].畜牧與飼料科學，2008,29（6）：1-3.

[12]王靜，王利紅，高艷，等.母乳蛋白質組學研究[J].中國乳品工業(yè)，2009,37（1）：4-9.

[13]DAVID P J,VAN K C,SMIT A,et al.Human Colostrum,Identification of Minor Proteins in the Aqueous Phase by Proteomics[J/OL]. Proteomics,2006,6(7):2208-2216.

[14]BOESMANFINKELSTEIN M,RICHARD F A.Sequential Purification of Lactoferrin,Lysozyme and Secretory Immunoglobulin a from Human Milk[J].FEBS Letters,1982,144(1):1-5.

[15]PETERSON F R.Electrofocusing of Milk Proteins[J].Journal of Dairy Science,1969,52(6):903.

[16]FERRER A P,COLASO A R,MARQUEZ E M,et al.Southern Elephant Seal(Mirounga Leonina)ii.Studies of Milk Protein Fractions by GEL Electrophoresis[J].Polar Biology,1996,16(4):241-244.

[17]MASAMICHI Y,MURAKAMI K,JOHN W C,et al.Identification of Low-Abundance Proteins of Bovine Colostral and Mature Milk Using Two-Dimensional Electrophoresis Followed by Microsequencing and Mass Spectrometry[J].Electrophoresis,2002,23(7):1153-1160.

[18]MURAKAMI K,LAGARDE M,YUKI Y D.Identification of Minor Proteins of Human Colostrum and Mature Milk by Two-Dimensional Electrophoresis[J].Electrophoresis,1998,19(14):2521-2527.

[19]KIM H H Y,JIMENEZ-FLORES R.Comparison of milk proteins using preparative isoelectric focusing followed by polyacrylamide GEL electrophoresis[J].Journal of Dairy Science,1994,77(8):2177-2190.

[20]ANDERSON N,POWERS M,TOLLAKSEN S.Proteins of human milk.i.identification of major components[J/OL].Clinical Chemistry, 1982,28:1045-1055.

[21]MARCIA G F,MAUREEN S S,JEAN I A.Two-Dimensional Electrophoretic Analysis of Human Milk Proteins[J/OL].Electrophoresis,1989,10(1):67-70.

[22]GOLDFARB M D.Two-Dimensional Electrophoretic Analysis of Human Milk-Fat-Globule Membrane Proteins with Attention to Apolipoprotein E Patterns[J].Electrophoresis,1997,18(3):511-515

[23]GOLDFARB M D.Two-Dimensional Electrophoresis and Computer Imaging:Quantitation of Human Milk Casein[J].Electrophoresis, 1999,20(4):870-874

[24]ISIDRA R,LOURDES A,ROSINA L F.Assessment of the Quality of Dairy Products by Capillary Electrophoresis of Milk Proteins[J]. Journal of Chromatography B,1997,697(1):231-242.

[25]JESùS L T,MóNICA R G R,MARíA A,et al.Detection of the Presence of SOYA Protein in Milk Powder by Sodium Dodecyl Sulfate Capillary Electrophoresis[J].Journal of Chromatography a,1999, 836(1):153-160.

[26]劉婷，姜金斗，劉寧.毛細管電泳檢測奶粉中添加的大豆分離蛋白[J].分析科學學報，2008,24（1）：37-41.

[27]張智武，許建香.3種電泳方法定量分析牛奶蛋白的比較[J].中國乳品工業(yè)，2005,33（8）：51-54.

[28]ISIDRA R,MóNICA R G R,ROSINA L F,et al.Detection of Rennet WHEY Solids in UHT Milk by Capillary Electrophoresis[J]. International Dairy Journal,2000,10(5):333-338.

[29]MANSO M A,MIGUEL M,LPEZ-FANDIOR.Application of Capillary Zne Electrophoresis to the Characterisation of the Human Milk Protein Profile and Its Evolution Throughout Lactation[J].Journal of Chromatography a,2007,1146(1):110-117.

[30]HOLLAR C M,LAW A J R,DALGLEISH D G,et al.Separation of major casein fractions using Cation-Exchange fast protein liquid chromatography[J].Journal of Dairy Science,1991,74(8):2403-2409.

[31]BORDIN G,CORDEIRO RAPOSO F,CALLE B.DE LA,et al. Identification and quantification of major bovine milk proteins by liquid chromatography[J].Journal of Chromatography a,2001,928(1): 63-76.

[32]王浩，張志國，常彥忠，等.RP-HPLC法對乳制品中主要牛奶蛋白的分離及定量測定[J].食品科學，2009（24）：376-380.

[33]王娟，張慶合，王志華，等.反相高效液相色譜法測定牛奶中的主要蛋白質[J].分析化學，2009（11）：1667-1670.

[34]JERZY D,DOROTA N,PIOTR M,et al.Identification and determination of milk and soybean protein preparations using enzymatic hydrolysis followed by chromatography and chemometrical data analysis[J].Analytica Chimica ACTA,2004,521(1):17-24.

[35]KRISTIAN H L,BJ?RN-HELGE M,ELLING-OLAV R,et al. Quantitative whole spectrum analysis with MALDI-TOF ms,part i: measurement optimisation[J].Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems,2009,96(2):210-218.

[36]CATINELLA S,SERAGLIA R,MARSILIO R.Evaluation of protein profile of human milk by matrix-assisted laser desorption,ionization mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,1999,13(14):1546-1549.

[37]GIANLUCA D P,FERRANTI P,MAMONE G,et al.Identification of N-Linked Glycoproteins in Human Milk by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography and Mass Spectrometry[J].Proteomics,2008,8(18):3833-3847

[38]石磊，劉曉梅，程舸，等.人乳中蛋白質的組成分析[J].應用化學，2010,27（9）：1099-1104.

[39]FROEHLICH J W,CHU C S,TANG NING,et al.Label-Free Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry Analysis with Automated Phosphopeptide Enrichment Reveals Dynamic Human Milk Protein Phosphorylation During Lactation[J].Analytical Biochemistry,2011,408(1):136-146.

[40]韓東海，魯超，劉毅，等.生鮮乳中還原乳的近紅外光譜法鑒別[J].光譜學與光譜分析，2007（3）：465-468.

[41]李亮，王雷鳴，丁武.近紅外光譜技術結合人工神經網絡鑒別生鮮奶和蛋白摻假奶[J].食品工業(yè)，2009（6）：67-70.

[42]MIRALLES B,BARTOLOMé B,AMIGO L,et al.Comparison of three methods to determine the WHEY protein to total protein ratio in milk[J].Journal of Dairy Science,2000,83(12):2759-2765.

[43]GONZáLEZ-MARTíN I,HERNáNDEZ-HIERRO J M,MOR? N-SANCHO R,et al.Determination of the percentage of milk (cow's,ewe's and goat's)in cheeses with different ripening times using near infrared spectroscopy technology and a remote reflectance fibre-optic probe[J].Analytica Chimica ACTA,2007,604(2):191-196.

[44]NICOLAOU N,XU Y,GOODACRE R.Fourier transform infrared spectroscopy and multivariate analysis for the detection and quantification of different milk species[J].Journal of Dairy Science,2010,93 (12):5651-5660.

[45]GARCíA T,MARTíN R,RODR?GUEZ E,et al.Detection of bovine milk in ovine milk by an indirect Enzyme-Linked immunosorbent assay[J].Journal of Dairy Science,1990,73(6):1489-1493.

[46]RODRíGUEZ E,MARTíN R,GARCíA T,et al.Detection of cows'milk in ewes'milk and cheese by a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay(elisa)[J].Journal of the Science of Food and A-griculture,1993,61(2):175-180.

[47]RODRíGUEZ E,MARTíN R,GARCíA T,et al.Indirect elisa for detection of goats'milk in ewes'milk and cheese[J].International Journal of Food Science&Technology,1991,26(5):457-465.

[48]BEER M,KRAUSE I,STAPF M,et al.Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of native and heat-denatured bovine β-lactoglobulin in ewes'and goats'milk cheese[J].Zeitschrift Für Lebensmitteluntersuchung UND-Fors, 1996,203(1):21-26.

[49]RICHTER W,KRAUSE I,GRAF C,et al.An indirect competitive elisa for the detection of cows’milk and caseinate in goats’and ewes’milk and cheese using polyclonal antibodies against bovine γcaseins[J].Zeitschrift Für Lebensmitteluntersuchung UND-Fors, 1997,204(1):21-26.

[50]HURLEY I P,COLEMAN R C,IRELAND H E,et al.Measurement of bovine IGG by indirect competitive elisa as a means of detecting milk adulteration[J].Journal of Dairy Science,2004,87(3): 543-549.

[51]ARANDA P,SáNCHEZ L,P?REZ M D,et al.Rapid immunoenzymatic method for detecting adulteration in ewe's milk[J].Food Control,1993,4(2):101-104.

[52]HURLEY I P,COLEMAN R C,IRELAND H E,et al.Use of Sandwich IgG ELISA for the Detection and Quantification of Adulteration of Milk and Soft Cheese[J].International Dairy Journal,2006, 16(7):805-812

[53]BERTINO E,PRANDI G,FABRIS C,et al.Human milk proteins may interfere in elisa measurements of bovine β-lactoglobulin in human milk[J/OL].ACTA Paediatrica,1996,85(5):543-549.

[55]INDYK H E.Development and application of an optical biosensor immunoassay for α-lactalbumin in bovine milk[J].International Dairy Journal,2009,19(1):36-42.

Application of protein analysis technology for components identificating and purity detecting of bovine milk and human milk

LI Yun-fei,FU Xu-mei,PENG Ze-ping,MENG Jie,ZHOU Yi-lai,BU Lin
(Liuan Initial Human Milk Bank Co.Ltd.,Liuan 237000,China)

This paper briefly summarized the differences on the content and features of major proteins in human milk,bovine milk and soybean,overviewed literatures that reported application to the separation and identification of milk protein and purity detection to the milk samples with electrophoresis,chromatography,mass spectra,spectrum and immunohistochemistry technology,compared the advantages and disadvantages of all methods.We conclude that denaturing gel electrophoresis is more suitable for the purity testing of human milk in early industrialization because of its easy and low cost.

human milk;components identification;purity detection

TS252.1

B

1001-2230（2011）06-0040-06

2011-03-06

李運飛（1975-），男，工程師，從事乳品科學研究。通訊作者：卜林