孫佰平，任娟，趙思峰，侯彩霞，王斌，劉啟鵬

（1新疆兵團化工綠色過程重點實驗室，石河子832003；2石河子大學(xué)綠洲農(nóng)作物病害防控重點實驗室，石河子832003）

響應(yīng)面法優(yōu)化球孢白僵菌CXJ－1的發(fā)酵工藝條件

孫佰平1，2，任娟2，趙思峰2，侯彩霞2，王斌2，劉啟鵬2

（1新疆兵團化工綠色過程重點實驗室，石河子832003；2石河子大學(xué)綠洲農(nóng)作物病害防控重點實驗室，石河子832003）

為了提高球孢白僵菌CXJ－1（Beauveria bassiana CXJ－1）在液體發(fā)酵過程中分生孢子的產(chǎn)孢量，采用響應(yīng)面法對球孢白僵菌CXJ－1產(chǎn)孢的發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化。采用單因素實驗確定了產(chǎn)孢發(fā)酵條件最適初始pH、發(fā)酵轉(zhuǎn)速和發(fā)酵溫度。通過Plackett－Burman實驗設(shè)計和Box－Behnken實驗設(shè)計響應(yīng)面分析優(yōu)化，確定了球孢白僵菌CXJ－1產(chǎn)孢最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：溫度28.07℃，轉(zhuǎn)速198.95r／min，初始pH 6.10，預(yù)測孢子濃度可達9.5×108個／mL，在優(yōu)化發(fā)酵條件下進行驗證實驗，孢子濃度達到9.7×108個／mL，表明驗證值和預(yù)測值有較高的吻合度。

球孢白僵菌；響應(yīng)面優(yōu)化；發(fā)酵工藝條件；產(chǎn)孢

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是一種昆蟲病原真菌，可通過寄主表皮侵入寄主，已被廣泛用于防治咀嚼式和刺吸式口器害蟲［1－2］，其具有安全有效、容易大量生產(chǎn)等優(yōu)點，在害蟲綜合治理系統(tǒng)中占有越來越重要的地位。球孢白僵菌主要靠分生孢子在昆蟲體表萌發(fā)后侵入昆蟲體內(nèi)而發(fā)揮殺蟲效能，因此生產(chǎn)高活力的分生孢子是研制真菌殺蟲劑的前提。

隨著球孢白僵菌生物殺蟲劑需求量的不斷增加，人們對球孢白僵菌的發(fā)酵方式和發(fā)酵培養(yǎng)方法開展了大量研究，季香云等［3］研究表明加有土樣成分配方可降低球孢白僵菌的生產(chǎn)成本；謝翎等［4］利用大米固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)可提高球孢白僵菌的產(chǎn)孢量，然而在白僵菌發(fā)酵過程中能影響發(fā)酵產(chǎn)孢量的因素除了發(fā)酵方式和培養(yǎng)方法以外，發(fā)酵工藝條件對球孢白僵菌的產(chǎn)孢影響也尤為重要。球孢白僵菌的芽生孢子、分生孢子和菌絲體侵染體均可以侵染昆蟲，其中液體深層發(fā)酵產(chǎn)生的液生孢子與氣生分生孢子類似［5］，因此通過優(yōu)化發(fā)酵工藝條件來提高白僵菌活性孢子量也是生產(chǎn)球孢白僵菌生防制劑的重要途徑之一。

傳統(tǒng)優(yōu)化發(fā)酵工藝的方法較多，有單因素法、正交實驗法、模糊邏輯學(xué)法和數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法等［6－7］，這些方法不但費時費力，而且常常忽略因子之間的交互作用，從而使得優(yōu)化結(jié)果不大理想［8］，往往不能達到真正的優(yōu)化。而響應(yīng)面法是微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化中常用的方法之一，它可建立連續(xù)的三維變量曲面模型，由此能反映出單因素和多種因素間的交互作用對微生物生長的影響［9］，因此被認為是較為準確可靠的優(yōu)化方法［10－11］。

本研究首先通過單因素試驗明確產(chǎn)孢發(fā)酵條件最適初始pH、發(fā)酵轉(zhuǎn)速和發(fā)酵溫，之后通過PB試驗明確了三因素對產(chǎn)孢量的影響大小，并且由此得出優(yōu)化的基本條件，再由最陡爬坡試驗逼近了三因素產(chǎn)孢量的最佳水平域，最后采用中心組合實驗設(shè)計（CCD）得出發(fā)酵條件最優(yōu)點，且較為系統(tǒng)考察了各個因素之間的交互作用，旨在為球孢白僵菌生防菌劑的開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

球孢白僵菌CXJ－1（Beauveria bassiana CXJ－1）分離于新疆因白僵菌嚴重侵染致死的懸燈蛾體內(nèi)，經(jīng)鑒定為球孢白僵菌，保藏于石河子大學(xué)綠洲農(nóng)作物病害防控重點實驗室，將保存好的菌種，接種到PDA平板上，活化備用。

1.1.2 所用培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g；葡萄糖20g；瓊脂15～20g；蒸餾水1000mL，0.1Mpa滅菌20min。Czapek培養(yǎng)基 （察氏培養(yǎng)基）：NaNO33.00g；K2HPO4·3H2O 1.00g；MgSO4·7H2O 0.50g；KCl 0.50g；FeSO4·7H2O 0.01g；蔗糖30.00g；蒸餾水1000mL，pH 7.0，0.1Mpa滅菌20min。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化和培養(yǎng)方法

將保藏的球孢白僵菌CXJ－1菌種接種于PDA平板上，置于培養(yǎng)箱中28℃下培養(yǎng)4d，備用。

1.2.2 培養(yǎng)方法

將直徑為5mm菌碟接種到含有100mL已滅菌的察氏培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，置于28℃，200r／min搖床培養(yǎng)3d。

1.2.3 孢子數(shù)量的測定

將已搖好的發(fā)酵液用4層滅菌紗布過濾出去菌絲，并用滅菌蒸餾水稀釋濾液100倍，之后進行孢子計數(shù)，孢子數(shù)量通過血球板計數(shù)法測定［12］。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 單因素試驗

影響球孢白僵菌產(chǎn)孢量的因素很多，本試驗選取對產(chǎn)孢量影響最大的3個因素，即初始pH、培養(yǎng)溫度和搖瓶轉(zhuǎn)速進行發(fā)酵條件優(yōu)化。

1.3.1.1 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)孢影響

以Czapek培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，在pH 7.0，200r／min條件下，滅菌冷卻后接入直徑為5mm菌碟，之后分別置于24、26、28、30及32℃5個待測溫度的搖床上搖培3d，最后進行孢子濃度的測定。每組試驗設(shè)置3個重復(fù)，最后取試驗結(jié)果數(shù)據(jù)的平均值。

1.3.1.2 初始pH 對產(chǎn)孢影響

以Czapek培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃、200r／min條件下，在滅菌前將發(fā)酵培養(yǎng)基pH調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0五個試驗值，滅菌冷卻后接入直徑為5mm菌碟搖培3d，然后進行孢子濃度的測定。每組試驗設(shè)置3個重復(fù)，最后取試驗結(jié)果數(shù)據(jù)的平均值。

1.3.1.3 搖瓶轉(zhuǎn)速對產(chǎn)孢影響

以Czapek培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，在28℃、pH 6.0條件下，滅菌冷卻后接入直徑為5mm菌碟，之后分別置于140、160、180、200及220r／min 5個待測轉(zhuǎn)速的搖床上搖培3d，最后進行孢子濃度的測定。每組試驗設(shè)置3個重復(fù)，最后取試驗結(jié)果數(shù)據(jù)的平均值。

1.3.2 Plackett－Burman（PB）設(shè)計

Plackett－Burman設(shè)計基于非完全平衡塊原理，能快速準確估計出主效因素和主效因素次序，以供進一步研究。本實驗在單因素實驗基礎(chǔ)上用該方法對pH（X1）、發(fā)酵溫度（X2）和轉(zhuǎn)速（X3）3種因素考察它們對產(chǎn)孢量影響的大小，選用N＝15的Plackett－Burman設(shè)計表，其中安排3個空項作誤差分析，各個參數(shù)代表因子及其水平見表1。每個試驗均搖培3d，最后進行孢子濃度的測定。每組試驗設(shè)置3個重復(fù)，最后取試驗結(jié)果數(shù)據(jù)取平均值。

1.3.3 最陡爬坡試驗

響應(yīng)擬合方程只能在臨近區(qū)域才能近似真實情形，在其他區(qū)域無法建立有效的響應(yīng)面擬合方程。根據(jù)PB試驗結(jié)果擬合出一階模型，由該模型回歸系數(shù)符號和大小來設(shè)計顯著因素爬坡方向和步長，最后逼近最優(yōu)響應(yīng)區(qū)域。

1.3.4 中心組合試驗

由單因素試驗得出最適培養(yǎng)溫度、初始pH和搖瓶轉(zhuǎn)速后，采用旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計法（Central composite rotatable design，CCD）對培養(yǎng)條件進行進一步優(yōu)化［13］。CCD試驗總數(shù)為2K＋2K＋n0，公式中K代表自變量總數(shù)，n0代表中心點試驗自變量xi按

xi＝（Xi－X0）／ΔXi，i＝1，2，3，… ， （1）式（1）中：xi為自變量Xi的編碼值，X0為自變量Xi在中心點的值，ΔXi為自變量變化步長［14］。

用多項式回歸分析對實驗數(shù)據(jù)進行擬合，得到二次多項式，該多項式描述響應(yīng)值與自變量關(guān)系的經(jīng)驗?zāi)Ｐ?，多項式回歸模型表達式：

式（2）中，Y 為響應(yīng)值，Xj為變量，b0為常數(shù)，bj為一次項回歸系數(shù)，bij為互作回歸系數(shù)，bij為二次項回歸系數(shù)。利用Design Expert軟件，采用Box－Behnken法進行中心組合設(shè)計［15］，每個因素取3個水平：±α（軸向點），±1（因素點）和中心點。根據(jù)相應(yīng)實驗設(shè)計進行實驗后，對實驗結(jié)果進行二次回歸擬合和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

培養(yǎng)溫度、最初pH和搖瓶轉(zhuǎn)速對球孢白僵菌產(chǎn)孢量有不同的影響（圖1）。

從圖1可看出，球孢白僵菌在26～32℃時均有較高的產(chǎn)孢量，在26～28℃，孢子濃度隨著溫度的上升而上升，當(dāng)?shù)竭_28℃時達到最大孢子濃度5.8×108個／mL，之后孢子濃度與溫度的上升成反相關(guān)關(guān)系。因此最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)溫度為28℃。在最適溫度的基礎(chǔ)上進行最適pH測定，試驗結(jié)果表明，在pH為5.0～8.0，白僵菌均能產(chǎn)生大量的孢子，孢子濃度隨著pH的增高而逐漸上升，當(dāng)pH為6時白僵菌孢子濃度達到最大，為9.0×108個／mL，當(dāng)pH大于6.0時，孢子濃度隨pH的增加而呈現(xiàn)遞減趨勢。因此確定球孢白僵菌產(chǎn)孢的最適pH為6.0。在最適培養(yǎng)溫度和最適初始pH條件下，進行最適轉(zhuǎn)速的確定，當(dāng)轉(zhuǎn)速為140r／min時，球孢白僵菌生長緩慢，當(dāng)轉(zhuǎn)速逐漸提高時，球孢白僵菌產(chǎn)孢量開始逐漸上升，轉(zhuǎn)速為200r／min時，產(chǎn)孢濃度達到最大值9.3×108個／mL，繼續(xù)增加轉(zhuǎn)速，孢子開始呈現(xiàn)下降趨勢，由此確定球孢白僵菌最適產(chǎn)孢轉(zhuǎn)速為200r／min。為了進一步提高產(chǎn)孢量，結(jié)合以上試驗結(jié)果進行中心組合試驗。

圖1 培養(yǎng)溫度、初始pH和搖瓶轉(zhuǎn)速對產(chǎn)孢的影響Fig.1Individual effect of incubation temperature，pH and flask speed on the spore yields

2.2 PB試驗設(shè)計

將單因素試驗篩選出的最適pH、溫度和轉(zhuǎn)速進行PB設(shè)計，PB實驗設(shè)計和結(jié)果如表1。

通過Design－Exper 7.0軟件對表1實驗結(jié)果數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果如表2。由表2可知，pH（P＝0.0001）、溫度（P＝0.0056）和轉(zhuǎn)速（P＝0.0056）三因子對產(chǎn)孢的影響均在90%概率水平上差異性明顯。剔除不顯著因子，通過逐步回歸得到如下方程：

Y＝0.68－0.048X1＋0.026X2＋0.026X3， （3）式（3）中，Y為球孢白僵菌CXJ－1孢子濃度的預(yù)測值；X1、X2和X3分別為pH、溫度和轉(zhuǎn)速的編碼值。以pH、溫度和轉(zhuǎn)速3個因子系數(shù)的正負值為爬坡的方向，在PB試驗中第15組為基礎(chǔ)進行爬坡試驗。

表1 PB實驗設(shè)計的變量與水平取值及實驗結(jié)果Tab.1The variations and levels of Plackett－Burman design and its result

續(xù)表1

表2 方差分析表Tab.2ANOVA of Plackett－Burman design

2.3 最陡爬坡實驗

最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 最陡爬坡試驗設(shè)計Tab.3Steepest ascent coordination path for all chosen factors at actual levels

由表3可知，X1、X2和X3三個因子濃度在試驗第2組附近時球孢白僵菌CXJ－1孢子濃度最高，說明實驗范圍最優(yōu)點可能在實驗第2組附近，故選擇第2組中三因子濃度作為中心組合實驗設(shè)計的中心點。

2.4 中心組合試驗

通過單因素試驗和PB試驗，大體上了解各個工藝參數(shù)對孢子濃度的影響。然而影響球孢白僵菌產(chǎn)孢的因素并不是孤立發(fā)生作用，它們之間共同發(fā)生作用，最終影響球孢白僵菌的產(chǎn)孢量。采用Box－Benhnken中心組合設(shè)計，以培養(yǎng)溫度、初始pH和搖瓶轉(zhuǎn)速為自變量，且分別以X1，X2和X3表示，以球孢白僵菌孢子濃度為因變量，即響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平相應(yīng)分析試驗，三水平的高、中、低分別用－1，0，1表示。具體編碼水平如表4所示，中心組合試驗方案及其試驗結(jié)果如表5所示。

表4 Box－Behnken響應(yīng)面設(shè)計試驗因素水平和編碼Tab.4Variables and levels in response surface design

表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.5Experimental design and results of response surface methodology

通過Design Expert 7.0軟件對實驗結(jié)果進行多元回歸分析，可以得出球孢白僵菌孢子產(chǎn)量的二階模型，剔除不顯著項，方程表示如下：

式（3）中：Y為球孢白僵菌CXJ－1產(chǎn)孢濃度預(yù)測值，X1、X2和X3分別為培養(yǎng)溫度、pH和搖瓶轉(zhuǎn)速的編碼值，二次項和交互項系數(shù)均為負值，可認為二次項和交互項方程主要對產(chǎn)孢濃度起負作用。

F檢驗反應(yīng)回歸模型的有效性，其包括失擬性檢驗等。方差分析結(jié)果見表6。由表6可知：上述模型可描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系，模型P＜0.05，表明該回歸模型顯著；失擬項P＝2.06，不顯著；相關(guān)系數(shù)R2＝0.9657，說明該模型擬合度良好，試驗誤差較小，R2Adj＝0.9040，表明上述模型可以解釋90.40%響應(yīng)值的變化，由上述可知通過此模型可分析和預(yù)測球孢白僵菌的產(chǎn)孢濃度。另外，X1和X3的交互作用（P＜0.05）與其他交互作用相比達到顯著水平，X12、X22和X32對產(chǎn)孢濃度的影響也極為顯著（P＜0.01）。

表6 孢子產(chǎn)量預(yù)測回歸模型的方差分析Tab.6Analysis of variance（ANOVA）for regression equation

2.5 兩因素之間的交互作用分析

由式（3）所作的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖2～4，各個因素及其交互作用對產(chǎn)孢濃度的影響結(jié)果可通過響應(yīng)面圖和等高線圖直觀的反映出來。可從等高線形狀反映交互作用的強弱，即越是橢圓形表示兩因素交互作用越顯著，反之越是標準圓形則表示交互作用不顯著［16］。

由圖2～4可知，隨著初始pH、培養(yǎng)溫度和搖瓶轉(zhuǎn)速的增加，孢子濃度的增加呈現(xiàn)先逐漸增大后開始下降的趨勢。通過對模型擬合分析，得出球孢白僵菌CXJ－1最佳產(chǎn)孢發(fā)酵工藝：初始pH值6.10；培養(yǎng)溫度28.07℃；搖瓶轉(zhuǎn)速198.95r／min，在此條件下預(yù)測孢子濃度為9.5×108個／mL。

圖2 培養(yǎng)溫度和搖瓶轉(zhuǎn)速對孢子濃度影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.2Response surface and contour plot showing the interactive effects of incubation temperature and flask speed on the spore yields

圖3 pH和搖瓶轉(zhuǎn)速對孢子濃度影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.3Response surface and contour plot showing the interactive effects of pH and flask speed on the spore yields

圖4 培養(yǎng)溫度和pH對孢子濃度影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4Response surface and contour plot showing the interactive effects of incubation temperature and pH on the spore yields

2.6 模型的驗證

利用分析所得的優(yōu)化發(fā)酵條件，結(jié)合實際情況選擇初始pH為6.1；培養(yǎng)溫度為28.07℃；搖瓶轉(zhuǎn)速為199r／min，在Czapek培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進行3d的發(fā)酵試驗，最后通過顯微鏡計數(shù)測定孢子濃度為9.7×108個／mL，與預(yù)測值極為接近，說明了該模型具有很好的預(yù)測性和可靠性。同時也證明了響應(yīng)面發(fā)優(yōu)化球孢白僵菌產(chǎn)孢工藝參數(shù)的可行性。

3 結(jié)論與討論

本試驗首先采用單因素試驗，得出了產(chǎn)孢發(fā)酵的最適pH、溫度和轉(zhuǎn)速，即：最適pH 6.0，最適溫度28℃，最適轉(zhuǎn)速200r／m。然后通過PB法，以球孢白僵菌孢子濃度為響應(yīng)值，明確了初始pH、溫度和轉(zhuǎn)速對球孢白僵菌產(chǎn)孢量的影響強弱，其中的pH（P＝0.0001）對產(chǎn)孢影響最為顯著，培養(yǎng)基是真菌生長的外部環(huán)境，菌絲體的生長依賴菌絲體內(nèi)酶的催化作用，而pH與酶活力的關(guān)系極為密切，因而，培養(yǎng)基初始pH對微生物代謝具有重要作用［17］。因此，本試驗結(jié)果，證明了PB方法是一種經(jīng)濟而有效的試驗方法。

通過旋轉(zhuǎn)中心組合試驗得到了培養(yǎng)溫度、pH和搖瓶轉(zhuǎn)速3因子對產(chǎn)孢量影響的數(shù)學(xué)模型：Y＝0.95－0.038X1X3－0.12X12－0.072X22－0.055X32。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，該模型相關(guān)系數(shù)R2＝0.9657，模型與實際情況符合很好，證明該模型能反映出3個因子對球孢白僵菌產(chǎn)孢量的影響。培養(yǎng)溫度和pH的交互作用達到顯著水平，且各個因子的二次效應(yīng)也極為顯著，說明培養(yǎng)溫度和pH對球孢白僵菌產(chǎn)孢量的影響較為復(fù)雜。最后通過模型確定出最佳發(fā)酵工藝條件為：初始pH為6.10；培養(yǎng)溫度為28.07℃；搖瓶轉(zhuǎn)速為198.95r／min，在此條件下進行發(fā)酵驗證，球孢白僵菌孢子濃度達到9.7×108個／mL，與優(yōu)化前相比產(chǎn)孢量提高了16.88%。

目前，通過利用響應(yīng)面法優(yōu)化球孢白僵菌發(fā)酵條件的研究鮮有報道，此外對球孢白僵菌的工業(yè)化生產(chǎn)，還有很多方面未深入解決，傳統(tǒng)的優(yōu)化方法并不能有效解決生產(chǎn)中各個參數(shù)的優(yōu)化，然而通過響應(yīng)面法可解決生產(chǎn)中多變量問題，還可以對工藝中各個因子水平和交互作用進行有效評價和優(yōu)化，快速確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，該方法比正交試驗相比更為有效，同時也證明了響應(yīng)面法優(yōu)化優(yōu)化球孢白僵菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件可行。

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Optimizatiom of Fermentation Conditons for Beauveria bassiana CXJ－1Spore by Response Surface Methodology

SUN Baiping1，2，REN Juan2，ZHAO Sifeng2，HOU Caixia2，WANG Bin2，LIU Qipeng2
（1Xinjiang Bingtuan Key Laboratory for Green Processing of Chemical Engineering Shihezi 832003，China；2The key laboratory of Prevention and Control for Oasis Crop Disease，Shihezi University，Shhezi 832003，China）

Response surface methodology was used to optimize fermentation conditons in order to improve spore production of Beauveria bassiana CXJ－1.The optimum fermentation temperature，rotation speed and pH were obtained with one－factor－attime.Through Plackett－Burman experimental design and Box－Behnken experimental design for response surface optimization，the optimal conditions for spore production of Beauveria bassiana CXJ－1were also determined as follows：temperature 28.07℃，rotation speed 198.95r／min and the pH value 6.10.Under these conditions，the predicted value of the concentration of spores was 9.5×108spores／mL and the verified value was 9.7×108spores／mL，the fermentation validation showed that the experimental value have high inosculating degree to model prediction.

Beauveria bassiana；response surface optimization；fermentation conditons；sporulation

Q815

A

1007－7383（2011）06－0689－07

2011－07－21

新疆兵團重大產(chǎn)學(xué)研專項（2010ZX03－1），國家科技支撐計劃項目（2011BAD48B02）

孫佰平（1984－），男，碩士生，專業(yè)方向為生物制劑和生化工程；e－mail：120933799＠163.com。

趙思峰（1975－），男，教授，碩士生導(dǎo)師，從事生物農(nóng)藥研究；e－mail：zhsf＿agr＠shzu.edu.cn。