苗貴東,杜 民,楊景峰,徐 營,樊廷俊,陳松林

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東青島266003;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島266071;3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海201306)

大菱鲆(Scophthalm usm axim us)在中國又稱“多寶魚”,是原產(chǎn)于歐洲沿海的一種名貴經(jīng)濟(jì)魚種,隸屬于硬骨魚類(Osteichthyes)、鰈形目(Pleuronectiformes)、鰈亞目(Pleuronectoidei)、鲆科(Bothidae)、菱鲆屬(Scophthalm us)。1992年引進(jìn)我國,1999年突破生產(chǎn)性育苗技術(shù),隨后大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)在我國得到迅速發(fā)展,現(xiàn)已成為我國北方沿海重要的魚類養(yǎng)殖品種。由于累代養(yǎng)殖和近親交配等因素,良種選育已經(jīng)成為我國大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展亟待解決的重要課題之一[1-2]。

家系選育是獲得優(yōu)良品種的重要手段。家系選育過程中,保持完整、準(zhǔn)確的系譜信息可

以有效的指導(dǎo)親本選留,從而避免近交衰退現(xiàn)象。大菱鲆良種培育中,為了實現(xiàn)家系遺傳參數(shù)的準(zhǔn)確評估,需要早期對不同家系進(jìn)行混養(yǎng),運(yùn)用微衛(wèi)星標(biāo)記輔助管理與物理標(biāo)記相比可以顯著降低遺傳育種中環(huán)境效應(yīng)因素的影響[3-4]。利用微衛(wèi)星技術(shù)進(jìn)行親子鑒定和遺傳分析已在真鯛(Chrysophrysm ajor)[3]、大西洋鳙鰈(H ippog lossus hippog lossus)[4]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[5]、虹鱒(Oncorhynchusm ykiss)[6]、中國對蝦(Penaeus chinensis)[7-8]、塞內(nèi)加爾鰨(Solea senegalensis)[9]等海洋經(jīng)濟(jì)動物中有相關(guān)報道。由于多重PCR(M utip lex PCR)技術(shù)具有高效、高通量、檢測成本低等優(yōu)點,自1988年Cham bercian等[10]首次建立這一技術(shù)起,該技術(shù)就已被廣泛應(yīng)用于多病毒、細(xì)菌高通量快速檢測[11-12]、群體遺傳分析[13]、親子鑒定[14]及數(shù)量性狀基因座位(Q TL)的定位[15]等研究。

Castro[16]和于非[17]等應(yīng)用微衛(wèi)星技術(shù)對大菱鲆親子鑒定及系譜構(gòu)建進(jìn)行初步研究,能夠完成對大菱鲆的親子鑒定工作,但現(xiàn)有方法存在檢測通量低、檢測工作量大、成本高、實現(xiàn)分子標(biāo)記輔助家系管理難度大等問題,無法在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。目前有關(guān)大菱鲆簡便、高通量親子鑒定和系譜認(rèn)證方法未見報道。本研究建立的微衛(wèi)星多重PCR技術(shù)將微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)的穩(wěn)定性與多重PCR技術(shù)的高通量特點結(jié)合,建立了大菱鲆的兩個微衛(wèi)星多重PCR體系,與現(xiàn)有方法相比,實現(xiàn)了對大菱鲆家系開展高效、高通量的親子鑒定目的。同時建立的大菱鲆非熒光標(biāo)記微衛(wèi)星多重PCR,克服常用的微衛(wèi)星多重PCR[13,15]多采用熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物,需要專用設(shè)備、儀器環(huán)境要求高,無法在養(yǎng)殖基地等潮濕環(huán)境檢測等缺點,能夠用于養(yǎng)殖基地現(xiàn)場親子鑒定和系譜認(rèn)證,可以用于分子標(biāo)記輔助良種選育工作。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用大菱鲆來自山東明波水產(chǎn)有限公司,2009年建立大菱鲆家系7個,家系編號分別為1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#,各家系數(shù)量大約500尾,隨機(jī)選取各家系35尾魚苗提取DNA,其中每個家系取20尾魚,用于建立親子鑒定多重PCR體系。另從每個家系中隨機(jī)取樣10尾用于雙盲實驗,其中3#家系母本缺失,7#家系無父母本信息。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取 取大菱鲆鰭條組織,利用傳統(tǒng)的酚、氯仿法提取大菱鲆基因組DNA[18]。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA完整性,利用RNA/DNA分光光度儀(Pharmacia Biotech L td.)進(jìn)行基因組DNA濃度的檢測并稀釋成100 ng/μL終濃度,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 18對大菱鲆微衛(wèi)星引物序列及其反應(yīng)條件Table 1 18 p rimer pair sequences and PCR reaction conditionsof S.maxim us

1.2.2 多重PCR設(shè)計 選用Sma2380、Sma2994、Sma1880、Sma2010、Sma2132、Sma2432、Sma-USC19、Sma-USC20、Sma-USC25、Sma-USC27、Sma-USC29、Sma-USC34、Sma-USC52、Sma-USC100、Sma-USC103、Sma-USC174、Sma-USC184、Sma-USC226共18對微衛(wèi)星引物(見表1)在7個家系11個已知親本中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從中篩選出多態(tài)性引物13對,這13對引物都能夠擴(kuò)增獲得3個及3個以上等位基因的清晰條帶。利用Primer Prem ier 5.0軟件進(jìn)行多重PCR引物組合設(shè)計,為了滿足多重PCR對預(yù)期片段大小及反應(yīng)退火溫度的要求,對13個位點中的部分位點依據(jù)其序列對引物進(jìn)行了重新設(shè)計,并分別命名為Sma-USC20-1和Sma-USC29-1。13個位點設(shè)計的3個多重PCR組合分別為Sma-USC25、Sma-USC20-1、Sma-USC100、Sma-USC103、Sma-USC29-1;Sma-USC27、Sma-USC37、Sma-USC100、Sma-USC184;Sma2380、Sma2994、Sma-USC19、Sma1880、Sma-USC226。經(jīng)過篩選去除擴(kuò)增效率低的引物組合及各組合中擴(kuò)增效率低的引物,多重PCR條件優(yōu)化主要是指優(yōu)化各組合中每對引物在體系中的最適宜的反應(yīng)濃度和獲得2個多重PCR組合反應(yīng)中最佳退火溫度和最佳循環(huán)次數(shù)。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的處理 PCR產(chǎn)物通過6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離,銀染,固定。將固定后的聚丙烯酰胺膠晾干后進(jìn)行基因型統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點遺傳多樣性分析

2個多重PCR反應(yīng)體系中各位點(除Sma-USC100,Sma226外)多態(tài)信息含量(PIC)均大于0.5,均為高度多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記,各位點等位基因數(shù)也較多,觀測雜合度較高,比較適合親子鑒定分析和群體遺傳評。

2.2 多重PCR結(jié)果

設(shè)計的引物組合經(jīng)過篩選后獲得2個穩(wěn)定的四重PCR體系。微衛(wèi)星位點組合分別為Sma-USC25、Sma-USC100、Sma-USC103、Sma-USC29-1和Sma2380、Sma2994、Sma-USC19、Sma226。經(jīng)條件優(yōu)化后最終獲得PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件如下:

第一組多重PCR的微衛(wèi)星位點組合為Sma-USC25、Sma-USC100、Sma-USC103、Sma-USC29-1。反應(yīng)體系為每個PCR反應(yīng)總體積15μL,包括100 ng基因組DNA,1×PCR緩沖液,Mg2+(1.5 mmol/L),1U Taq酶,dNTPs 0.2 mmol/L。引物組合Sma-USC25、Sma-USC100、Sma-USC103、Sma-USC29-1,上、下游引物分別為0.25μmol/L。PCR反應(yīng)條件為:95℃變性5 min;95℃45 s,58℃50 s,72℃50 s,10個循環(huán);95℃30 s,55.5℃50 s,72℃50 s,25個循環(huán);95℃30 s,50℃50 s,72℃50 s,10個循環(huán),72℃延伸5 min,10℃保存。

第二組多重PCR的微衛(wèi)星位點組合為Sma2380、Sma2994、SmaUSC19、Sma226。反應(yīng)體系為每個PCR反應(yīng)總體積15μL,包括100 ng基因組DNA,1×PCR緩沖液,Mg2+(1.5 mmol/L),1U Taq酶,dNTPs 0.2 mmol/L。引物組合Sma2380、Sma2994、Sma-USC19、Sma226,上、下游引物0.25μmol/L、0.3μmol/L、0.25μmol/L、0.25μmol/L。PCR反應(yīng)條件為:95℃變性5 min;95℃45 s,57℃50 s,72℃50 s,10個循環(huán);95℃30 s,55℃50 s,72℃50 s,25個循環(huán);95℃30 s,50℃50 s,72℃50 s,10個循環(huán),72℃延伸5 min,10℃保存。

2.3 多重PCR結(jié)果

PCR經(jīng)電泳后,根據(jù)已知親本及產(chǎn)物片段大小進(jìn)行基因型統(tǒng)計(見圖2),以pBR322/M spⅠM arker(天根生化有限公司)確定等位基因大小(見圖1)。

圖1 第一組多重PCR體系親本丙烯酰胺凝膠電泳圖(顯示其中2個位點)Fig.1 Acrylamide gel electrophoresis of know n Families’parent of No.1 multiplex PCR(Shown two loci)

圖2 部分雙盲個體丙烯酰胺凝膠電泳圖(顯示其中2個位點)Fig.2 The partial acrylamide gel electrophoresis of double-blind experiment in 70 trout(Show n two loci)

2.4 聚類分析

利用N TSYS-pc2.1軟件,計算7個家系140個子代個體和70個雙盲子代個體的遺傳距離(GD),分別得到140個大菱鲆個體遺傳距離矩陣(140×140)和70個雙盲數(shù)據(jù)的遺傳距離矩陣(70×70)。根據(jù)個體間的遺傳距離,利用N Tsys2.1和M EGA 4.0軟件按UPGM A法進(jìn)行聚類分析。140個已知家系信息個體的聚類分析結(jié)果表明:136個個體的聚類結(jié)果與已知家系信息相一致,聚類準(zhǔn)確率為97.14%;70個雙盲個體的聚類分析結(jié)果與真實結(jié)果比對后有66個個體能夠準(zhǔn)確確定其父母,4個個體聚類錯誤,聚類分析準(zhǔn)確率為95.71%(見圖3,4)。分析后發(fā)現(xiàn)聚類錯誤個體均存在某些位點未擴(kuò)增出條帶現(xiàn)象,從而導(dǎo)致無法獲得基因型。

圖3 140個體NTsys聚類分析圖(顯示40個個體)Fig.3 The partial cluster analysis diagram in 140 turbot(Show n 40 individuals)

圖4 70個雙盲個體聚類分析結(jié)果(Mega4.0)Fig.4 Cluster analysis of 70 double-blind individuals by Mega4.0 software

表2 各微衛(wèi)星引物基因型信息及家系特異等位基因/特異基因型組合Table 2 Genotype of 8 microsatellite loci and specific alleles or specific genotypes in 7 families

2.5 推斷缺失親本的基因型

大菱鲆親本和家系個體基因型的命名方法依據(jù)各引物擴(kuò)增條帶大小。從小到大依次對每個等位基因排序為a,b,c…,如Sma-USC25擴(kuò)增獲得目的片段大小分別為315 bp、343 bp、420 bp、432 bp、452 bp則5個條帶分別命名為Sma-USC25-a、Sma-USC25-b、Sma-USC25-c、Sma-USC25-d、Sma-USC25-e,其他引物命名方法與此相同(見表2)。由于微衛(wèi)星標(biāo)記符合孟德爾遺傳規(guī)律,由已知親本基因型和家系個體基因型可以推斷出缺失親本的基因型(見表2)。

2.6 多重PCR親子鑒定排除率分析和親子鑒定準(zhǔn)確率分析

運(yùn)用軟件N Tsys分別對140個已知家系信息個體進(jìn)行系譜認(rèn)證及70個雙盲個體進(jìn)行系譜認(rèn)證分析,將140個子代個體和70個雙盲子代個體基因型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為軟件N Tsys2.1所需的(0,1)矩陣格式,分別得到140個個體遺傳距離矩陣(140×140)和70個雙盲數(shù)據(jù)的遺傳距離(GD)矩陣(70×70)。根據(jù)個體間的遺傳距離,分別利用N TSYS-pc2.1和M EGA 4.0軟件按UPGMA法進(jìn)行聚類分析,140個個體和70個雙盲個體聚類分析結(jié)果表明,分別有97.14%和95.71%與預(yù)期的家系信息相一致(見圖3,4)。結(jié)果表明2個多重PCR可以實現(xiàn)對7個家系個體的系譜認(rèn)證。通過對7個家系140個個體遺傳參數(shù)的計算,得到各引物的期望雜合度、觀測雜合度、多態(tài)信息含量及排除率(表3):在雙親未知的情況下2個多重PCR的8個微衛(wèi)星位點累積排除概率為96.58%,已知單親基因型時累積排除概率為99.71%。親子鑒定的準(zhǔn)確率為96.42%。親子鑒定分析利用Cervus2.0軟件,依次進(jìn)行等位基因的頻率分析、模擬分析(Simulation)和親子分析(Parentage analysis),對隨機(jī)取樣的70個個體雙盲進(jìn)行實驗,結(jié)果為:在雙親未知時累積排除率為95.72%,已知1個親本時累積排除率為99.61%。親子鑒定結(jié)果為:92.86%的個體能夠準(zhǔn)確找到各自父母(見表4)。

表3 微衛(wèi)星各位點在家系中遺傳信息Table 3 Info rmation of themicrosatellite sites

表4 70個雙盲個體親子鑒定結(jié)果Table 4 The result of parentage determination in 70 individuals

3 結(jié)論與討論

目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中個體的父母信息不能直接獲得,運(yùn)用分子手段實現(xiàn)個體親子鑒定和系譜追蹤對家系選育和輔助親本管理提供重要幫助,目前微衛(wèi)星標(biāo)記是實現(xiàn)上述目的較為理想的標(biāo)記。[19]利用微衛(wèi)星位點的多態(tài)性,以排除概率方法進(jìn)行親子鑒定和系譜認(rèn)證,是明確個體間親緣關(guān)系、建立系譜關(guān)系的重要手段。Ellegren等[20]研究表明,使用5個微衛(wèi)星位點組合(每個位點有6個以上的等位基因)時排除率為98%,而使用10個這樣的微衛(wèi)星組合時排除率可高達(dá)99.99%。Castro[16]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有一個單親基因型記錄時,要達(dá)到95%以上的累積排除概率至少需要8個中的4個多態(tài)微衛(wèi)星位點,而親本基因型均未知時,則至少需要8個中的7個多態(tài)位點。Cervus2.0軟件評估了本實驗2個多重PCR體系中8個微衛(wèi)星位點在雙親未知情況下的累積排除概率是96.58%,而已知1個親本時的累積排除概率達(dá)99.71%。這8個微衛(wèi)星位點平均等位基因數(shù)是6.125,其中Sma-USC29-1、Sma2380、Sma19 3個位點超過了6個等位基因,且平均PIC值為0.6558,表明2個微衛(wèi)星多重PCR體系總體已達(dá)到高度多態(tài)性水平,其累積排除率達(dá)到96.42%。這與上述2個結(jié)果基本一致。同時又從7個家系隨機(jī)選取70尾個體進(jìn)行雙盲實驗,利用Cervus2.0軟件分析雙親未知時的排除率為95.72%,已知1個親本時的排除率為99.61%,表明本研究建立的由8個微衛(wèi)星位點組合成的2個多重PCR體系可以實現(xiàn)比普通PCR方法更高效的親子鑒定分析。已建立的2個多重PCR體系理論上的排除率與雙盲實驗結(jié)果接近,也與已發(fā)表的結(jié)果基本一致[4-5,7,17],表明本研究建立的2個多重PCR體系具有較好的穩(wěn)定性和可靠性。N Tsys2.1和M ega4.0對70尾魚雙盲分析表明,其群體水平的聚類分析準(zhǔn)確率為95.71%,4尾魚的聚類結(jié)果出現(xiàn)偏差的原因是,該4個個體均存在1個或幾個位點無擴(kuò)增條帶現(xiàn)象,也可能與某些位點等位基因差別較小而產(chǎn)生基因型統(tǒng)計誤差、有些引物在某些個體可能存在PCR擴(kuò)增中引物滑動現(xiàn)象有關(guān)。70尾魚雙盲鑒定結(jié)果親子鑒定準(zhǔn)確率92.86%,能夠滿足實際生產(chǎn)對家系管理的需要。Lerceteau-K?hler[14]使用10個微衛(wèi)星位點組合成的1個六多重PCR和1個四重PCR用于700尾河鱒(Salmo trutta)養(yǎng)殖群體和野生群體的篩選,只需14塊左右96孔板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,而普通引物方法篩選則需要使用大約70塊96孔板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,上述10個引物組合的2個多重PCR效率約為普通方法的5倍,同時減少多次重復(fù)性工作,與本實驗2個四重PCR檢測效率比現(xiàn)有的簡單PCR方法提高2～3倍,檢測費(fèi)用大大減少的結(jié)果相一致。

目前研究中采用的多重PCR技術(shù),多采用具有熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行多重PCR體系的設(shè)計和篩選,該方法建立的多重PCR由于不同引物采用不同顏色的熒光標(biāo)記[14,21-22],只需考慮引物間相容性,各引物擴(kuò)增片段大小可以交叉重疊,因此常見的多重PCR體系容易建立,但引物需要預(yù)先進(jìn)行熒光標(biāo)記、檢測熒光信號需要專有設(shè)備,檢測成本較高。水產(chǎn)生物育種和生產(chǎn)中環(huán)境濕度大,環(huán)境濕度過大使儀器設(shè)備維護(hù)困難,易造成熒光信號檢測誤差甚至無法獲得檢測結(jié)果,因此常用的熒光標(biāo)記多重PCR方法很難在養(yǎng)殖基地推廣應(yīng)用。本研究從生產(chǎn)實際需要出發(fā),采用無熒光標(biāo)記的普通微衛(wèi)星引物篩選建立了2個多重PCR體系,利用常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳設(shè)備進(jìn)行親子鑒定分析,對環(huán)境要求低,應(yīng)用范圍更加廣泛,可以實現(xiàn)養(yǎng)殖基地現(xiàn)場快速、高通量的親子鑒定分析,也可用于家系群體遺傳多樣性評價、分子輔助家系管理及分子輔助親本選擇。

多重PCR體系建立主要解決的問題是選擇合適微衛(wèi)星位點進(jìn)行組合和PCR反應(yīng)條件的

優(yōu)化,本研究采用以下基本原則進(jìn)行試驗設(shè)計:①多重PCR引物組合的各引物間有較好的相容性,要求同一引物內(nèi)上、下游及各引物之間均不形成二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等,若無法避免也要求其穩(wěn)定性較低。②盡可能避免引物之間的競爭抑制現(xiàn)象,各引物在同一PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率相近。③盡可可能使用多堿基重復(fù)類型微衛(wèi)星位點組合,如四堿基重復(fù)序列的微衛(wèi)星位點與二堿基重復(fù)序列的微衛(wèi)星位點相比一般不產(chǎn)生或較少出現(xiàn)影子帶(Stuttering)[23-24],能夠減少基因型統(tǒng)計錯誤。④盡可能使用完美型或者接近完美型的微衛(wèi)星標(biāo)記,因為這樣的微衛(wèi)星位點組合更接近于SMM突變模型,減少由于無效等位基因產(chǎn)生而出現(xiàn)雜合子缺失的現(xiàn)象[25]。由于本研究使用非標(biāo)記引物建立多重PCR體系,在遵循常規(guī)多重PCR設(shè)計的基本原則基礎(chǔ)上還要考慮到便于基因型統(tǒng)計,從而選取的各位點的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小需要存在一定間隔。本實驗采用4～6個引物組合時各引物預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別為大于300 bp、240～300 bp、200～240 bp、160～200 bp、120～160 bp和小于120 bp。

由于限制因素多,本研究中在多重PCR引物的選擇上難度比較大,可選引物數(shù)量較少,除選用3～4堿基重復(fù)序列(Motif)微衛(wèi)星標(biāo)記外,同時輔以部分?jǐn)U增條帶清晰的2堿基重復(fù)序列的微衛(wèi)星標(biāo)記。本研究首先設(shè)計4～6個引物的PCR體系進(jìn)行篩選和條件優(yōu)化,剔除組合中擴(kuò)增效率低的引物,最終獲得2個較為穩(wěn)定的四重PCR體系。為了更好的進(jìn)行基因型統(tǒng)計分析并減少統(tǒng)計誤差,消除不同批次凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小的統(tǒng)計誤差,并且pBR322/M spⅠM arker分子量標(biāo)準(zhǔn)并非均勻分布,為保證每批檢測樣本基因型統(tǒng)計結(jié)果的可比性,同時使用已知親本位于待測樣本兩側(cè)和pBR322/M spⅠ雙重分子量標(biāo)準(zhǔn)輔助進(jìn)行基因型分析,使基因型統(tǒng)計準(zhǔn)確率更高,在本研究中取得了較好的效果。

實驗結(jié)果顯示7個家系中某些位點等位基因數(shù)少,遺傳多態(tài)性較低,家系間遺傳距離較小,親緣關(guān)系較近。這可能是因為我國不是大菱鲆的原產(chǎn)地,引進(jìn)原種親緣關(guān)系較近的原因。由于魚類后代眾多,管理難度大,利用微衛(wèi)星多重PCR對引進(jìn)原種進(jìn)行分析來確定親本親緣關(guān)系、利用分子標(biāo)記手段輔助選擇苗種親本以及家系選育中引入分子標(biāo)記手段輔助家系管理和群體管理,與運(yùn)用表型性狀進(jìn)行傳統(tǒng)選育方法相比,能夠有效減少由于近交導(dǎo)致的遺傳多樣性下降的現(xiàn)象,這將加快選擇育種進(jìn)程,有望縮短培育優(yōu)良品種(品系)時間,能夠有效促進(jìn)大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

總之,本研究建立的2個微衛(wèi)星多重PCR體系與現(xiàn)有的簡單PCR方法相比,效率提高了2～3倍,檢測成本大大降低。同時建立的基于非熒光標(biāo)記引物的2個多重PCR體系與常用熒光標(biāo)記引物多重PCR相比,無需特殊檢測設(shè)備,適用范圍更廣,能夠?qū)崿F(xiàn)在養(yǎng)殖生產(chǎn)基地現(xiàn)場檢測。本研究建立的2個多重PCR體系實現(xiàn)了通過已知親本和子代的基因型來推斷未知的3個親本的基因型;通過群體聚類分析的結(jié)果獲得家系系譜關(guān)系;對70個個體進(jìn)行雙盲實驗,親子鑒定準(zhǔn)確率達(dá)92.86%,與已知個體信息的鑒定結(jié)果(96.42%)相近,表明該方法具有很好的可靠性。以上結(jié)果表明建立的2個多重PCR體系能夠高效的對大菱鲆進(jìn)行群體遺傳學(xué)評價、系譜認(rèn)證、親子鑒定,也能夠用于分子標(biāo)記輔助家系管理和分子標(biāo)記輔助親本選擇。

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