姜雯婷，戴好富，劉壽柏，梅文莉*

(1.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海南海口571737;2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，海南海口571101;3.?？谑袩釒烊划a(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?71101)

煙草青枯病是由茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)引起的煙草一大毀滅性病害。該病廣泛分布于全世界的熱帶、亞熱帶和一些溫暖的地區(qū)，在我國煙草產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，局部地區(qū)發(fā)病嚴(yán)重［1］。青枯菌寄主范圍廣泛，可侵染54個(gè)科的450余種植物［2］。煙草青枯病的防治長期依賴化學(xué)防治，病原易產(chǎn)生抗藥性，故防效不明顯，化學(xué)藥劑的毒性強(qiáng)，對環(huán)境危害嚴(yán)重，且影響著煙葉的產(chǎn)量，是煙葉生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展中亟待解決的關(guān)鍵問題，所以尋找有效防治青枯病的技術(shù)與方法，是當(dāng)今植物病理學(xué)研究的重要課題之一［3-4］。從植物中尋找對有害生物有抑制活性或殺傷作用的物質(zhì)是開發(fā)新農(nóng)藥的一個(gè)主要方法［5］。海南島藥用植物資源豐富，有維管束植物4 500多種，藥用植物3 100多種，其中特有的黎族藥近800種［6-7］，為尋找具有抗煙草青枯菌活性的熱帶藥用植物提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用濾紙片法和2倍稀釋法，對52種熱帶藥用植物的乙醇提取物進(jìn)行煙草青枯菌的抑菌活性篩選，旨在尋找具有抗煙草青枯病活性的藥用植物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料共采集了52種熱帶藥用植物，分屬于31科47屬(表1)，主要采自海南?？?、儋州、昌江等地。植物樣品由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所代正福副研究員鑒定，憑證標(biāo)本現(xiàn)存于熱帶生物技術(shù)研究所。

表1 供試熱帶藥用植物樣品Table 1 Samples of tropical medicinal plants tested

1.1.2 供試菌株煙草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)由云南大學(xué)生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室莫明和教授提供。

1.1.3 培養(yǎng)基［8］牛肉膏蛋白胨固體和液體培養(yǎng)基(NA培養(yǎng)基):牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水1 000 mL，調(diào)pH值至7.4～7.6，固體培養(yǎng)基:瓊脂20 g。

1.1.4 試劑甲醇、乙醇、氯化鈉均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠;牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉均為生物化學(xué)試劑，購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.5 儀器HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋，日本HIRAYAMA公司;SW-40潔凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;ZD-8802D搖床，太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Q/BKYY31-2000電恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;HHB11360-S普通培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;Delta 320-S pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 樣品和藥液的制備［9］樣品采集后自然晾干后，粉碎;用乙醇冷浸提取3次，分別浸提7、7、5 d，提取液合并在50℃下減壓濃縮至干，獲乙醇提取物。濃縮干燥后所得的浸膏用甲醇定容為質(zhì)量濃度100 mg/mL的溶液，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌懸液制備［10］將煙草青枯菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)將菌株轉(zhuǎn)移至裝有液體培養(yǎng)基三角瓶中，30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，振動(dòng)頻率250 r/min。加入無菌生理水，稀釋成濃度為106個(gè)/mL的菌液。

1.2.3 抑菌試驗(yàn)［11-12］采用濾紙片法進(jìn)行測定。在營養(yǎng)瓊膠培養(yǎng)基平板上加入100 μL細(xì)菌懸浮液并涂布均勻。取樣品溶液10 μL，滴加到直徑6 mm的滅菌濾紙片上，風(fēng)干，制成含提取物干質(zhì)量劑量為1 mg的含藥濾紙片。然后用無菌鑷子夾取將含藥濾紙片倒置貼于細(xì)菌營養(yǎng)平板上，并輕輕按壓使充分接觸，每個(gè)平板5片，每處理重復(fù)3次。中間以相同劑量的甲醇溶液為對照。置30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后用十字交叉法測量抑菌圈直徑，求平均值。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測定［13-14］對于抑菌效果明顯的提取物，采用2倍稀釋法，從質(zhì)量濃度100 mg/mL開始依次濃度減半，設(shè)置濃度梯度對煙草青枯菌進(jìn)行作用，濃度梯度依次為100、50、25、12.5、6.25、3.31、1.56 mg/mL，從而測定最低抑菌濃度(MIC)。在無菌條件下，按照前面的抑菌試驗(yàn)方法進(jìn)行，以剛好出現(xiàn)抑菌圈的濃度值作為最低抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈大小測定結(jié)果

本試驗(yàn)一共測試了52種熱帶藥用植物對煙草青枯菌的抑菌作用，活性結(jié)果見表2。共有13種藥用植物顯示抑菌活性，抑菌圈大小依次為光葉巴豆＞酒餅簕＞簕欓花椒＞許樹=大管＞荔枝草＞光葉紫玉盤＞牛筋果=白欖樹＞細(xì)基丸＞鉤枝藤＞蜂巢草=長春花。其中光葉巴豆的活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為12 mm;抑菌圈直徑＞8 mm的熱帶藥用植物有6種，分別為酒餅簕、簕欓花椒、許樹、大管、荔枝草和光葉紫玉盤。這13種熱帶藥用植物分別屬于9科13屬，表現(xiàn)了抗菌植物的多樣性。

表2 13種熱帶藥用植物乙醇提取物對煙草青枯菌的抑菌圈直徑Table 2 Diameter of inhibition zone of ethanol effects from 13 species of tropical medicinal plants against Ralstonia solanacearum

2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定結(jié)果

利用2倍稀釋法測定13種熱帶藥用植物抗煙草青枯病原菌的最小抑菌濃度(MIC)，結(jié)果見表3。酒餅簕的最小抑菌濃度為3.31 mg/mL，光葉巴豆和許樹的最小抑菌濃度均為6.25 mg/mL，表現(xiàn)為較強(qiáng)的活性。

表3 13種熱帶藥用植物乙醇提取物對煙草青枯菌的MICTable 3 The mensuration result of MIC of 13 species of tropical medicinal plants against Ralstonia solanacearum

3 討論

通過對52種熱帶藥用植物抗煙草青枯菌活性的初步篩選，結(jié)果表明，共有13種藥用植物顯示有抗煙草青枯菌的活性，其中光葉巴豆、酒餅簕和許樹的活性最強(qiáng)，其余呈現(xiàn)不同強(qiáng)度的抑菌活性。據(jù)鄭全喜等［15］報(bào)道，植物抑菌的主要成分是各種精油、酚類、生物堿和黃酮類等物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中測定的長春花、鉤枝藤中富含生物堿［16-17］，細(xì)基丸、光葉巴豆中含有黃酮［18-19］。因此，光葉巴豆、酒餅簕和許樹等13種藥用植物的活性大小可能與含有此類化合物有關(guān)，但不排除其他有效成分存在較強(qiáng)的抑菌作用可能性。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明抑菌圈大小與其相應(yīng)的MIC值不一定成平行關(guān)系，這可能是由于其提取物含有多種成分而各成分的活性強(qiáng)度各不相同所致［20］，因此，還需進(jìn)一步跟蹤、研究提取物中各成分的抑菌活性大小及抑菌機(jī)理。實(shí)驗(yàn)僅在室內(nèi)離體測定了植物樣品乙醇提取物的抑菌活性，提取物在活體上的表現(xiàn)如何，在田間試驗(yàn)中能否表現(xiàn)防治作用，都還有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)對提取物的抗煙草青枯菌活性進(jìn)行研究，為煙草青枯病的防治提供新的思路，

也為熱帶藥用植物資源的開發(fā)和利用提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］ 劉雅婷，張世光.煙草青枯病的研究進(jìn)展［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，16(1):72-76.

［2］ Wicker E，Grassart L，Coranson Beaudu R，et al.Ralstonia solanacearum Strains from Martinique(French West Indies)Exhibiting a New Pathogenic Potential［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73(21):6790-6801.

［3］ 鄭繼法，丁愛云，張建華，等.煙草青枯病研究進(jìn)展［J］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，29(4):527-531.

［4］ 孫思，韋愛梅，伍慧雄，等.青枯病的化學(xué)與生物防治研究進(jìn)展［J］.江西植保，2004，27(4):158-162.

［5］ 駱焱平，鄭服叢，楊葉.128種南藥植物提取物對6種病原菌的生長抑制作用［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2004，25(4):106-111.

［6］ 陳偉平.海南省南藥資源概況［J］.熱帶林業(yè)，2004，3(32):8-11.

［7］ 鄭才成.海南黎藥發(fā)展研究概況［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2007，13(5):2-3.

［8］ 沈萍，范秀榮，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第3版)［M］.北京:高等教育出版社，1999:214-215.

［9］ 張慧，徐大高，潘汝謙，等.一些植物提取物的抗菌活性篩選［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2008，38(4):441-444.

［10］ 姜寧，劉曉鵬，滕建勛，等.紫油厚樸葉提取物對馬鈴薯青枯病菌的抑制作用及防病效果［J］.植物保護(hù)，2008，34(2):58-60.

［11］ Daayf F，Schmitt A，Belanger R.The effects of plant extracts of Reynoutria sachalinensis on powdery mildew development and leaf physiology of long English cucumber［J］.Plant Disease，1995，79(6):577-580.

［12］ Agrios G N.Plant pathology(Fifth Edition)［M］.California，USA:ElsevierAcademic Press，2005:315-316.

［13］ 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)(第3版)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1985:1063-1069.

［14］ 林雄平，陳曉清，蘇育才.金銀花和苦丁茶多糖提取物抗菌活性研究［J］.亞熱帶植物科學(xué)，2008，37(1):51-53.

［15］ 鄭全喜，蘇顯中，王河清，等.中草藥體外抑菌作用的研究進(jìn)展［J］.中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2009，4(4):295-298.

［16］ 祖元?jiǎng)?，羅猛，牟瑤松，等.長春花生物堿成分及其藥理作用研究進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18(2):325-329，294.

［17］ 蘇志恒，劉明生，李占林，等.鉤枝藤化學(xué)成分的研究［J］.中國藥物化學(xué)雜志，2007，17(6):383-385.

［18］ Kanchanapoom T，Sommit J，Kasai R.Chemical Constituents of Thai Medicinal Plant，Polyalthia cerasoides［J］.Natural medicines，2002，56(6):268-271.

［19］ 鄒國安，王媛，楊峻山，等.毛葉巴豆化學(xué)成分的研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2009，44(11):819-821.

［20］ 左國營，韓峻，余巍，等.47種中草藥提取物的體外抗菌活性篩選研究［J］.中國藥房，2005，16(10):798-799.