許 拉, 李天保, 葉海斌, 蓋春蕾, 朱安成, 張 偉

(山東省海水養(yǎng)殖研究所 山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實驗室, 山東 青島 266002)

寄生養(yǎng)殖大菱鲆的海洋盾纖類纖毛蟲(弗州擬尾絲蟲相似種)的形態(tài)學(xué)和18S rDNA序列分析

許 拉, 李天保, 葉海斌, 蓋春蕾, 朱安成, 張 偉

(山東省海水養(yǎng)殖研究所 山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實驗室, 山東 青島 266002)

從養(yǎng)殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)患病魚體中分離出一種寄生纖毛蟲, 通過活體觀察、碳酸銀法染色對其形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分析, 初步鑒定為弗州擬尾絲蟲相似種(Parauronemacf.virginianumThompson, 1967)。同時對其18S rDNA序列進(jìn)行了測定和分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析, 結(jié)果顯示該纖毛蟲序列與弗州擬尾絲蟲(Parauronema virginianum)存在8個堿基的差異, 序列相似性為99%, 表明二者的高度相似性。在對本纖毛蟲的18S rDNA序列和GenBank中報道的14種相關(guān)盾纖類纖毛蟲相應(yīng)序列相似性和進(jìn)化距離分析的基礎(chǔ)上, 作者構(gòu)建了包括迄今所有相關(guān)、已知種類的系統(tǒng)進(jìn)化樹。本研究為海水魚類相關(guān)病害的病原鑒定提供了一份新的數(shù)據(jù)和資訊。

大菱鲆(Scophthalmus maximus); 盾纖蟲; 弗州擬尾絲蟲(Parauronema virginianum); 碳酸銀染色; 18S rDNA

大菱鲆(Scophthalmus maximus)自1992年引入中國以來, 取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益。然而近幾年來, 除細(xì)菌和病毒性疾病外, 寄生蟲病的危害也越來越突出, 其中由嗜組織的盾纖類纖毛蟲所引起的危害十分突出, 產(chǎn)生了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-6]。

據(jù)文獻(xiàn)報道, 迄今國內(nèi)從養(yǎng)殖鲆鰈類病魚體表潰爛組織中分離出的該類纖毛蟲中, 已鑒定出有貪食邁阿密蟲(Miamiensis avidus), 蟹棲異阿腦蟲(Mesanophrys carcini), 指狀擬舟蟲(Paralembus digitiformis) 以及水滴偽康纖蟲(Pseudocohnilembus persalinus)[2-6]。

作者新近從大菱鲆病魚組織中分離出一種纖毛蟲, 形態(tài)學(xué)分析, 初步鑒定為弗州擬尾絲蟲相似種;并測定了該纖毛蟲的18S rDNA基因序列, 分析比較了與之相關(guān)的14種盾纖毛蟲相應(yīng)序列的同源性, 構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹, 從分子序列方面進(jìn)一步確定了該纖毛蟲的系統(tǒng)分類地位[7]。

1 材料與方法

1.1 盾纖毛蟲的培養(yǎng)

2007年8月至2008年6月, 從山東煙臺、威海、青島等地患病養(yǎng)殖大菱鲆取樣, 自體表、鰓和內(nèi)臟分離出病原纖毛蟲, 過濾海水為培養(yǎng)液, 加新鮮大菱鲆魚肉, 室溫培養(yǎng)2～3 d。

1.2 纖毛蟲的形態(tài)學(xué)與分類鑒定

形態(tài)學(xué)研究方法包括: 光學(xué)顯微鏡活體觀察、碳酸銀染色法[8-9]。本文采用的分類系統(tǒng)參照Corliss(1994)。

1.3 DNA的提取

蟲體經(jīng)福爾馬林固定后, 3 000～3 500 r/min離心富集, 取富集蟲體培養(yǎng)液50 μL, 加入450 μL裂解緩沖液(10 mmol Tris-HCl, pH 8.3; 50 mmol KCl; 2.5 mmol MgCl2; 0.6%Tween 20; 0.6%Nonidet P40; 60 mg/L Proteinase K), 56°C水浴1～2 h, 常規(guī)酚氯仿法抽提, 用50 μL滅菌雙蒸水溶解DNA沉淀, -20℃保存?zhèn)溆肹10]。

1.4 PCR擴(kuò)增18S rDNA基因序列

選擇 Elwood等[11]報道的通用引物 16S-like-F:5’-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’, 16S-like-R:5’-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3’進(jìn)行擴(kuò)增,該引物能擴(kuò)增大多數(shù)盾纖類纖毛蟲近乎全長的小亞基 rRNA基因[12], 由上海生工生物有限公司合成。50 μL的PCR反應(yīng)體系中包含: 1× PCR緩沖液, 1.5 mmol/L MgCl2, 200 μmol/L dNTP 混合物, 1 μmol/L引物16S-like-F和16S-like-R, 1μL DNA模板。PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5 min后, 加入Taq DNA聚合酶, 初始的5個循環(huán)為94°C變性1 min, 56°C退火2 min, 72°C延伸2 min, 后35個循環(huán)將退火溫度提升為62℃, 最后72°C延伸5 min, 于4°C結(jié)束反應(yīng)。用1%的瓊脂糖電泳, Genefinder染色后, 在紫外下觀察條帶, DL2000用做DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 基因的克隆與測序

采用北京博日膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物,利用T-A連接, 按pMD18-T載體說明書將純化后適量的PCR產(chǎn)物直接連接至pMD18-T載體中, 按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到Escherichi coli感受態(tài)細(xì)胞, 使用選擇性LB瓊脂平板篩選含重組質(zhì)粒的白色克隆, 接于含有Amp的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng), 通過PCR驗證后送大連寶生物有限公司進(jìn)行DNA雙向測序。

1.6 DNA序列分析及數(shù)據(jù)處理

將測序所得到的纖毛蟲18S小亞基 rDNA序列在 GenBank數(shù)據(jù)庫中 BLAST查找, 收集相關(guān)的 14種盾纖目纖毛蟲的小亞基 rRNA基因序列, 采用ClustalW1.83軟件進(jìn)行多序列比對(Multiple Alignment), 用系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件 MEGA4.1進(jìn)行統(tǒng)計和聚類分析。用Kimura雙參數(shù)模型計算各序列分化距離, 缺少和不確定位點(diǎn)在計算中被省略, 采用鄰接法(neighbor-Joining method)獲得系統(tǒng)發(fā)生樹, 并通過自舉分析(bootstrap)進(jìn)行置信度檢測, 自舉數(shù)據(jù)集為1000次。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)

由于種種原因, 我們在對所獲蟲體的觀察和研究中, 雖然沒有得到詳細(xì)的口器結(jié)構(gòu)等全面信息,但根據(jù)宋微波[13]對發(fā)現(xiàn)自瀕死幼蝦體內(nèi)的弗州擬尾絲蟲(Parauronema.virginianum)的描述, 本研究的樣本與該種在大小、主要形態(tài)特征上均相似。考慮到該類群普遍具有的兼性寄生的特性, 可以認(rèn)定本寄生纖毛蟲應(yīng)為弗州擬尾絲蟲的相似種。其主要形態(tài)特征如下:

活體約 36μm×16μm(長×寬), 外形穩(wěn)定, 呈瓜子型, 皮膜無缺刻, 體前部具多個晶體, 內(nèi)質(zhì)無色,中央?yún)^(qū)為較透明的大核。蟲體頂端略尖, 呈小的截面,為裸毛區(qū)(AP)?？趨^(qū)約占體長的 1/2, 體纖毛長約6～8 μm, 尾纖毛約 18 μm。伸縮泡直徑可達(dá) 5 μm, 位于體后端。運(yùn)動呈旋轉(zhuǎn)式快速前進(jìn)。蟲體喜聚集在營養(yǎng)豐富的基質(zhì)上, 成極高的密度, 并可通過橫二分裂快速繁殖(圖1 A-C)。

銀染結(jié)果顯示, 本種體動基列為10-12列。蟲體近頂端的小膜 1(M1)呈短三角形, 由數(shù)個毛基粒組成, 小膜 2(M2)為相互平行的 2排縱行的毛基粒列,小膜3為斜向的2排毛基粒列?？趥?cè)膜(PM)起始于M2中部, 至 M3前端為一單列毛基粒, 后變?yōu)殡p動基列構(gòu)造, 并至胞口(Cs)后。大、小核各一個, 位于體中部。大核(Ma)為不規(guī)則的橢圓形, 長 10.6 μm,小核(Mi)近球形, 長 3 μm, 緊位于大核側(cè)邊(圖1 D-F)。

2.2 18S rDNA基因PCR克隆

以提取的DNA為模板, 16S-like-F和16S-like-R為引物, 擴(kuò)增出 1條約為 1.7 kb的目的片段。PCR產(chǎn)物回收純化后與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化, 篩選得到陽性克隆, 將得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行 PCR擴(kuò)增鑒定, 結(jié)果如圖2。

挑選陽性克隆經(jīng)DNA雙向測序, 得到1條長度為1758 bp的近乎全長的18S rDNA基因片段, GC含量為 42.4%, 片段大小和組分與相近屬種的已知序列相近。所得序列已提交 GenBank, 登錄號為FJ595488。

2.3 序列比較與系統(tǒng)進(jìn)化分析

將測定的該纖毛蟲 18S rDNA基因序列與GenBank內(nèi)登錄的14種不同種屬的盾纖類纖毛蟲相應(yīng)序列進(jìn)行比對, 序列間的同源性和進(jìn)化距離分析見表2。如表所示, 實驗纖毛蟲與 14種纖毛蟲的序列相似度在 79%～99%之間, 而與Parauronema. virginianum(AY392128)相似度最高, 達(dá)到99%, 有7個堿基的差異, 與其遺傳距離為 0.01。采用的 MEGA 4.1軟件構(gòu)建的分子進(jìn)化樹顯示新測序列(FJ595488)與Parauronema.virginianum(AY392128)以最高置信值(100%)聚為一枝, 之后與Uronema marinum(DQ867072)相聚(100%), 而與其他種類相距較遠(yuǎn)(圖3)。

圖1 弗州擬尾絲蟲相似種的形態(tài)學(xué)特征Fig. 1 Morphological characteristics of Parauronema cf. virginianum derived from cultured turbot

表1 弗州擬尾絲蟲相似種的統(tǒng)計學(xué)特征(自碳酸銀制片標(biāo)本, 測量單位: μm)Tab. 1 Biometrical characterrization of Parauronema cf. virginianum (Data based on specimens prepared by silver carbonated staining)

3 討論

目前國內(nèi)外已有大菱鲆纖毛蟲病的報道, 證明了感染大菱鲆的病原纖毛蟲不止一種, 并且無明顯的宿主選擇性。西班牙學(xué)者Iglesias等鑒定感染大菱鲆的病原為Philasterides dicentrarchi。而后, Song和Wilbert[3]等根據(jù) Iglesias提供的詳細(xì)資料, 將其更正為貪食邁阿密蟲(Miamiensis avidusThompson, 1964),國內(nèi)王印庚等[4]報道了大菱鲆盾線蟲病是由一種嗜組織的蟹棲異阿腦蟲(Mesanophrys carcini)寄生而引起的, 并在病原纖毛蟲流行病學(xué), 病原學(xué)、組織病理學(xué)及防治方法等方面做了較詳細(xì)的研究。

本文所涉的病原纖毛蟲與徐奎棟、宋微波等[13-14]分離自貝類中的弗州擬尾絲蟲形態(tài)特征有較大的相似性, 但在口器小膜1(M1)和小膜3(M3)略有不同。結(jié)合分子信息, 我們可以認(rèn)定此危害種為一與弗州擬尾絲蟲高度相似的擬尾絲蟲, 由其引起養(yǎng)殖大菱鲆盾纖蟲病, 在國內(nèi)屬首次報道。此也表明了感染大菱鲆的病原纖毛蟲不止一種。

在對其18S rDNA序列比較分析中, 本文克隆測序所得序列(FJ595488)與弗州擬尾絲蟲AY392128序列同源性為 99%, 遺傳距離為 0.005, 在構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹中高置信度地聚為一支, 而與之前學(xué)者報道的感染大菱鲆的貪食邁阿密蟲(Miamiensisavidus) AY550080、蟹棲異阿腦蟲(Mesanophrys carcini)AY103189的相似性分別為 91%、92%, 遺傳距離分別為0.09、0.10, 與之前報道的感染牙鲆的指狀擬舟蟲(Paralembus digitiformis)AY297715、水滴偽康纖蟲(Pseudocohnilembus persalinus)AY835669的相似性分別為91%、79%, 遺傳距離分別為0.10、0.25。在構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹中上述 4種纖毛蟲18S rDNA序列分別聚類在4個不同分支上, 與本文測定的纖毛蟲18S rDNA序列(FJ595488)不在一個類群分支上。通過分析比較18S rDNA序列進(jìn)一步驗證本文研究的纖毛蟲與弗州擬尾絲蟲親緣關(guān)系最近, 而與之前報道的寄生類纖毛蟲有明顯的差異。鑒于對本種的分類學(xué)信息仍欠完備, 此妨礙了種類鑒定的進(jìn)一步開展, 我們期待在后期的工作中完成對此寄生蟲的廓清工作。

圖2 18S rDNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、回收純化及重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 The results of 18S rDNA gene PCR amplification,recovery, purification and recombinant plasmid PCR amplification

表2 15種相近盾纖類纖毛蟲18S rDNA基因序列相似性和進(jìn)化距離Tab. 2 Sequence similarity and evolutionary distance of 18S rDNA gene of 15 ciliates

圖3 以18S rDNA基因序列構(gòu)建的相關(guān)類群的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic relationship of related ciliates based on 18S rDNA gene sequences

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Morphological studies and 18S rDNA sequence analysis of the marine scuticociliateParauronemacf.virginianum(Protozoa,Ciliophora) isolated fromScophthalmus maximus

XU La, LI Tian-bao, YE Hai-bin, GAI Chun-lei, ZHU An-cheng, ZHANG Wei
(Shandong Mariculture Research Institute, Key Laboratory for Mariculture Disease Treatment of Shandong Province, Qingdao 266002, China)

Dec., 23, 2010

Scophthalmus maximus; Scuticociliatosis;Parauronemacf. virginianum; silver carbonate staining; 18S rDNA

A parasitic ciliate isolated from the cultured flatfishScophthalmus maximuswas analyzed in the present paper. Morphological investigations were performed using living observation and silver carbonate staining method.The data of the body shape, size, structure of buccal apparatus, macro- and micronucleus, as well as the somatic ciliature showed that the parasitic ciliate was similar toParauronema virginianum. The molecular phylogenetic characters were analyzed to further determine the classification of the parasitic ciliate. The 18S rDNA of the ciliate was sequenced (GenBank accession number is FJ595488), and it only had 8 different bases compared with those ofP. virginianum. They shared 99% similarity insequence. The 18S rDNA of the ciliate was also compared with those of 14 related ciliates. Phylogenetic dendrogram was constructed based on the genetic distance analysis, which revealed that this organism andP. virginianumclustered into one branch, with their genetic distance of 0.005. Based on the obtained results, the isolated ciliate was identified as aParauronema-similar taxon, that is,P.cf. virginianum.

S941 Q959 文獻(xiàn)標(biāo)識碼: A 文章編號: 1000-3096(2011)12-0036-06

2010-12-23;

2011-04-19

山東省科技攻關(guān)項目(2007GG10005006)

許拉(1981-), 男, 湖南湘潭人, 碩士, 主要從事水產(chǎn)動物病害防治學(xué)研究, E-mail: gene05@163.com; 李天保, 通信作者, 研究員,主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治, E-mail; ltb1601@126.com

張培新)