沈德龍，劉甲鋒，李力，陳慧君，關(guān)大偉，姜昕，李俊

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京100081)

秸稈腐熟菌劑是有機(jī)物料腐熟劑中的一個(gè)重要品種，它指采用現(xiàn)代化學(xué)和生物技術(shù)，經(jīng)過特殊的生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的、能夠加速農(nóng)作物秸稈腐熟、分解的活體微生物制劑。近年的研究和實(shí)踐證明，應(yīng)用具有快速降解秸稈物料的腐解菌劑，是解決秸稈還田問題的關(guān)鍵。目前，研制開發(fā)理想的作物秸稈快速腐熟劑已成為微生物制劑研發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，研究腐解過程中微生物區(qū)系的演替對(duì)于深入了解腐解的機(jī)理、優(yōu)化復(fù)合菌系生產(chǎn)工藝具有重要意義。采用傳統(tǒng)平板分離方法只能對(duì)復(fù)合菌系中的可培養(yǎng)微生物組成進(jìn)行研究，而復(fù)合菌系中還含有不可培養(yǎng)的微生物，分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)使之研究變?yōu)榭赡?，PCR-DGGE適于準(zhǔn)確分析腐解過程中微生物區(qū)系的動(dòng)態(tài)變化［1-2］。1993年，在Muyzer等［3］首次將該技術(shù)應(yīng)用于微生物生態(tài)的研究后，其迅速被應(yīng)用于環(huán)境微生態(tài)方面的研究。徐大勇等［4］采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和PCR-DGGE技術(shù)研究了人工接種堆肥和自然堆肥微生物群落的演變過程;李國(guó)媛等［5］采用分子生物學(xué)方法和傳統(tǒng)平板分離方法對(duì)秸稈腐熟菌劑細(xì)菌菌群及在腐熟過程中的變化進(jìn)行分析;而王小芬等［6］也以苜蓿為原材料，研究了乳酸菌復(fù)合系A(chǔ)12在苜蓿青貯過程中微生物區(qū)系動(dòng)態(tài)變化。本課題組曾分離篩選了具有降解水稻秸稈能力的復(fù)合菌系RSS-4［7］，并對(duì)其在傳代過程中的腐解特性進(jìn)行了研究［8］。本文采用平板計(jì)數(shù)法和PCR-DGGE技術(shù)對(duì)腐解過程中微生物區(qū)系的演變進(jìn)行了研究，旨在明確稻稈腐解過程中微生物菌群的組成與變化，為秸稈腐解菌劑的菌系篩選優(yōu)化與菌劑生產(chǎn)及應(yīng)用提供分子微生態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種為本實(shí)驗(yàn)室自行篩選構(gòu)建的稻稈腐解復(fù)合菌系RSS-4。

1.1.2 培養(yǎng)條件固體發(fā)酵培養(yǎng)基：稻稈粉(粉碎后過60目篩)75 g，麩皮(粉碎后過60目篩)30 g，營(yíng)養(yǎng)鹽溶液100 mL，水50 mL，攪拌均勻，自然pH，不對(duì)其進(jìn)行滅菌，接菌后22℃靜置培養(yǎng)。

1.1.3 腐解過程中微生物數(shù)量的變化菌落平板計(jì)數(shù)按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB20287-2006的規(guī)定執(zhí)行。

1.2 方法

1.2.1 腐解過程中細(xì)菌的DGGE分析①基因組DNA的提?。涸诟膺^程的第2、4、6、8、10、12、14、16、18天分別取樣，采用Bead-beater法提取基因組DNA，其操作步驟見文獻(xiàn)［9］;②細(xì)菌基因組16S rDNA V3可變區(qū)的擴(kuò)增：16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增見文獻(xiàn)［10］。擴(kuò)增引物分別為P2：5'-attaccgcggctgctgg-3';P3：5'-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggcctacgggaggcagcag-3'。25 mL的PCR擴(kuò)增體系：10×buffer(不含Mg2+)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，氯化鎂(25 mmol/L)2 μL，引物(10 pmol/μL)1 μL，Taq酶(2.5 U/μL)0.15 μL，稀釋模板1 μL，dd H2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃，4 min;94℃，1 min;65→56℃，1 min;72℃，1 min(每個(gè)溫度2個(gè)循環(huán));94℃，1 min;55℃，1 min;72℃，1 min(10個(gè)循環(huán));72℃，6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè);③Reconditioning PCR及產(chǎn)物純化：取16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的十分之一作模版，以與16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增相同的反應(yīng)體系和條件，再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，但是把循環(huán)數(shù)減少到3;④16S rDNA V3可變區(qū)的多態(tài)性DGGE分析：制作變性劑尿素和甲酰胺梯度膠，用梯度生成儀灌膠。膠板大小為16 cm×16 cm，聚丙烯酰胺的濃度為8%，變性劑的濃度范圍為30%～60%(100%變性劑濃度為7 mol/L尿素，40%甲酰胺)。樣品上樣量為30 μL，電壓75 V，電泳16 h后，EB染色20 min，用GEL DOC EQ凝膠成像系統(tǒng)成像。對(duì)于典型的條帶，從膠中切出，再經(jīng)PCR擴(kuò)增后供堿基序列測(cè)定。

1.2.2 腐解過程中真菌的DGGE分析①18S rDNA區(qū)PCR擴(kuò)增：基因組DNA的提取見1.2.1①。18S rDNA區(qū)PCR擴(kuò)增見文獻(xiàn)［11］。擴(kuò)增引物分別為R1616：5'-gcggtgtgtacaaagggcaggg-3';F1427：GC5'-cgcccgccgcgccccgcgcccggccgccgcccccgcccct-ctgtgatgcccttagatgttctggg-3'。25 μL的PCR擴(kuò)增體系見1.2.1②。PCR反應(yīng)條件：94℃，5 min;94℃，0.5 min;52℃，1 min;68℃，1.5 min，25個(gè)循環(huán);68℃，10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè);②18S rDNA區(qū)的多態(tài)性DGGE分析：具體的操作步驟見1.2.1④。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐解過程中微生物數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化

用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定復(fù)合菌系RSS-4在對(duì)稻稈分解過程中細(xì)菌和真菌的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果見圖1和圖2。由圖1可知，在腐解的0～4 d內(nèi)細(xì)菌借助易分解利用的可溶性糖和淀粉等物質(zhì)急劇增加，細(xì)菌數(shù)量最高達(dá)到10.0×1011cfu/g，此后隨著易利用物質(zhì)的減少，細(xì)菌的數(shù)量發(fā)生區(qū)系更替，真正起腐解作用的細(xì)菌開始起作用，其整體數(shù)量雖然有所下降，但基本保持在4.0×1011cfu/g以上，這一階段正是木質(zhì)纖維素被快速腐解的時(shí)期。8 d后隨著底物的利用越來越難加之產(chǎn)物反饋抑制，細(xì)菌的數(shù)量略有下降，但基本穩(wěn)定在2.0×1011cfu/g以上。

圖1 稻稈腐解過程中細(xì)菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of bacteria during the straw's decomposition

圖2 稻稈腐解過程中真菌生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of fungi during the straw's decomposition

由圖2可知，在腐解過程中真菌的含量與細(xì)菌相比要少得多，其生長(zhǎng)曲線也與細(xì)菌有所不同，在腐解初期即呈下降趨勢(shì)，它在腐解的8～10 d內(nèi)含量最低，在腐解的第12天有小幅上升，然后趨于穩(wěn)定。由圖2可見，在整個(gè)腐解過程中真菌的數(shù)量變化不是很劇烈，這說明真菌可能在腐解全程都在發(fā)揮作用。

2.2 腐解過程中細(xì)菌的DGGE分析結(jié)果

2.2.1 樣品總DNA提取結(jié)果本實(shí)驗(yàn)采用珠式細(xì)胞破碎器(Bead-beader)的方法提取復(fù)合菌系RSS-4基因組DNA。采用該法提取的基因組DNA片段主要集中在3.0～10.0 kb之間，雖然有少量的彌散帶存在，但是最長(zhǎng)DNA可達(dá)10.0 kb以上，能夠滿足實(shí)驗(yàn)需要;且由于此方法主要依靠物理方法破壁，受微生物種類差異的影響較小，故樣品中DNA的提取較為全面。此方法簡(jiǎn)潔高效，適用于大批量DNA的提取。

2.2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果將樣品的DNA進(jìn)行COMMUNITY PCR擴(kuò)增，得到了與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增片斷，片段大小約為250 bp，瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果見圖3。Reconditioning PCR結(jié)果見圖4。

2.2.3 16SrDNA-DGGE結(jié)果復(fù)合菌系在腐解不同時(shí)期的16S rDNA V3區(qū)-DGGE見圖5。由圖5可知，在稻稈腐解過程中，不同腐解時(shí)期細(xì)菌的組成呈現(xiàn)出多樣性，變化差異也較為明顯。條帶1、4、7、8、9和10在整個(gè)腐解過程內(nèi)一直存在，為優(yōu)勢(shì)菌，而其中又以1、9和10條帶更亮，說明其含量應(yīng)該更高，為主要優(yōu)勢(shì)菌種;條帶3在腐解初期沒有出現(xiàn)，到第4天開始出現(xiàn)并一直維持到腐解結(jié)束;類似的還有條帶11和13;而條帶12只在腐解的初期出現(xiàn)，之后迅速消失;條帶6除在第6～8天不明顯外，其余時(shí)期均存在;而條帶2卻是交叉出現(xiàn)的，其含量變化不定。將以上條帶割膠回收，克隆并測(cè)序，在GeneBank中比對(duì)后得出結(jié)果見表1。比對(duì)結(jié)果顯示最高同源性的菌株大部分為不可培養(yǎng)的細(xì)菌。

圖5 復(fù)合菌系RSS-4在不同腐解時(shí)期的16S rDNA PCR-DGGE圖Fig.5 16SrDNA PCR-DGGE profile of fungus components of CMS during the straw's decomposition

表1 復(fù)合菌系的細(xì)菌變性梯度膠電泳圖中各條帶的近緣菌株Table 1 Identities of DGGE bands of microbial community

其中，純培養(yǎng)所得的Pseudomonas sp.對(duì)應(yīng)DGGE圖譜中的條帶1;其中優(yōu)勢(shì)菌株條帶1(Pseudomonas stutzeri)、條帶8(Bacillus sp.)和非優(yōu)勢(shì)菌株條帶5(Alcaligenes sp.)均已證實(shí)具有降解秸稈的功能。如余金勇等［12］通過剛果紅法初步證明從白蟻腸分離的菌株(Bacillus sp.)能產(chǎn)生纖維素酶，表明其具有分解纖維素的能力。

2.3 腐解過程中真菌的DGGE分析結(jié)果

2.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果將樣品的DNA進(jìn)行COMMUNITY PCR擴(kuò)增，得到了與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增片斷，片段的大小約為260 bp，瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果見圖6。

圖6 18SrDNA區(qū)片段PCR擴(kuò)增的電泳圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis of 18S rDNA region segment amplified by PCR

2.3.218 S rDNA-DGGE DGGE結(jié)果復(fù)合菌系在腐解不同時(shí)期的18S rDNA DGGE見圖7。

圖7 復(fù)合菌系RSS-4在不同腐解時(shí)期的18S rDNA PCR-DGGE圖Fig.718 S rDNA-DGGE profile of fungus components of CMS during the straw's decomposition

由圖7可知，復(fù)合菌系在腐解不同時(shí)期的18S rDNA DGGE如圖中3～9所示，在稻稈腐解過程中，不同腐解時(shí)期真菌的組成呈現(xiàn)出多樣性，變化差異較為明顯。其中，條帶6、7、8、9、12、13、16和18在整個(gè)腐解過程內(nèi)一直存在，為優(yōu)勢(shì)菌，而其中又以8、9和13條帶更亮，說明其含量應(yīng)該更高，為主要的優(yōu)勢(shì)菌種;條帶10和11在腐解的初期沒有出現(xiàn)，到第4天開始出現(xiàn)并一直維持到腐解結(jié)束;條帶3直到第6天才開始出現(xiàn)，但是直到腐解結(jié)束一直存在;類似的還有條帶17，它僅在腐解的第14天才開始出現(xiàn);條帶16除了第4天不明顯外，其余時(shí)間均出現(xiàn);而條帶1、2、4、5、14和15均在腐解的不同時(shí)期偶爾出現(xiàn)一段時(shí)間后迅速消失。將以上條帶割膠回收，克隆并測(cè)序，在GeneBank中比對(duì)后得出結(jié)果見表2。

表2 復(fù)合菌系的真菌變性梯度膠電泳圖中各條帶的近緣菌株Table 2 Identities of DGGE bands of microbial community

由表2可知，復(fù)合菌系RSS-4中的克隆子與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知真菌的18S rDNA序列相似性最高的為100%，最低的為96%;其中可培養(yǎng)的真菌條帶數(shù)共有11個(gè)，占庫(kù)容總量的61.1%。這表明文庫(kù)中大部分真菌為可培養(yǎng)真菌。其中，純培養(yǎng)所得的Graphium penicillioides、Mucor circinelloides分別對(duì)應(yīng)DGGE圖譜條帶中的13和10。根據(jù)已有報(bào)道，主要條帶中有纖維素分解功能的菌株有條帶10(Mucor circinelloides)和木質(zhì)素分解功能的條帶13(Graphium penicillioides)，如王嵐等［13］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)擬青霉所產(chǎn)的木聚糖酶和木糖苷酶協(xié)同作用可將樺木木聚糖完全降解成木糖;而有些至今還未發(fā)現(xiàn)其具有腐解秸稈的能力，但是它們的存在很可能會(huì)幫助消除腐解產(chǎn)物，起到協(xié)同作用，從而共同促進(jìn)了稻稈的腐解。

3 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和PCR-DGGE技術(shù)研究了水稻秸稈腐解復(fù)合菌系RSS-4在腐解過程中菌種區(qū)系變化情況。

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法顯示，在稻稈腐解過程中，微生物的數(shù)量均呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢(shì)，在整個(gè)腐解過程中細(xì)菌的數(shù)量占優(yōu)勢(shì)，真菌的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化不明顯。其中，細(xì)菌數(shù)量在腐解第4天高達(dá)10.0×1011cfu/g，在稻稈腐解第8天依然保持在4.0×1011cfu/g以上，這一階段正是木質(zhì)纖維素被快速腐解的時(shí)期，說明在稻稈腐解前期中細(xì)菌可能起主要作用。

16S rDNA-DGGE結(jié)合克隆測(cè)序共得到12個(gè)測(cè)序結(jié)果。在稻稈腐解過程中，不同腐解時(shí)期細(xì)菌的組成也呈現(xiàn)出多樣性，變化也較為明顯。其中，Pseudomonas stutzeri(X98607.1)、Uncultured bacterium clone R2J3M4_C5(GQ467097.1)、Rhodanobacter sp.LAA-2009-i12(FN298498.1)、Uncultured planctomycete clone Jx19-28(GQ443676.1)、Bacillus sp.IWF41(GU120654.1)、Uncultured bacterium clone A-6(EF579784.1)和Uncultured bacterium clone areia_48(GQ996480.1)為優(yōu)勢(shì)菌株，它們貫穿于稻稈腐解的整個(gè)過程;Pseudotrichomonas sp.2003-5005(DQ412644.1)在腐解的前期起作用，而后迅速消失;Alcaligenes sp.(FJ531636.1)和Klebsiella pneumoniae(EU078621.1)在腐解的后期才出現(xiàn)而起作用，而Uncultured bacterium clone C_M_03_11(FJ470745.1)則是交叉出現(xiàn)的。

復(fù)合菌系RSS-4的18S rDNA-DGGE結(jié)合克隆測(cè)序的結(jié)果顯示，最少有18種真菌參與到稻稈的腐解。在稻稈腐解過程中，不同腐解時(shí)期真菌的組成呈現(xiàn)出多樣性，變化差異也較為明顯。其中，Telotrochidium matiense strain CCAP 1655/2(AY611065.1)、Uncultured eukaryote clone EC72(AY817011.2)、Uncultured eukaryote clone EUKDPK69(DQ104585.1)、Telotrochidiummatiense(EF417835.2)、Petalomonas cantuscygni CCAP 1259/1(AF386635.1)、Graphiumpenicillioides strain HSAUP042563(FJ914664.1)、Bodo sp.coconut/BRA/1988(FJ839605.1)和18 Ochromonadaceae environmental sample clone Elev_18S_1192(EF024705.1)為優(yōu)勢(shì)菌株;而Uncultured eukaryote clone EC37(AY817000.2)、Uncultured eukaryote clone DLN-J-70(FJ848498.1)、Leukarachnion sp.ATCC PRA-24(FJ356265.2)、Honigbergiella ruminantium strain KOJ14(AY319280.1)和Geomyces destructans isolate 20674-10(FJ231102.1)在腐解的前期起作用，而后迅速消失;Uncultured fungus(AB262844.1)、Uncultured fungus clone T3_II_2a_21(EF628587.1)、Mucor circinelloides(AM745433.1)、Unculturedeukaryoteclone D2P04B10(EF100248.1)和Spumella sp.Mbc_3C(AB425951.1)在腐解的后期才出現(xiàn)而起作用。

以上結(jié)果表明采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和PCRDGGE技術(shù)可以較好地對(duì)水稻秸稈腐解復(fù)合菌系RSS-4在腐解過程中菌種區(qū)系變化情況進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)有多株細(xì)菌和多株真菌存在于稻稈腐解過程中，且區(qū)系變化較為明顯。腐解過程中不同時(shí)期由不同優(yōu)勢(shì)菌株扮演重要角色共同促進(jìn)了稻稈的腐解，所有這些結(jié)果為秸稈腐解菌劑工藝的生產(chǎn)和應(yīng)用提供分子生態(tài)學(xué)依據(jù)。

［1］ 翟振華，李艷雙.變性梯度凝膠電泳技術(shù)在微生物分子生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通報(bào)—技術(shù)與方法，2009(5)：55-58.

［2］ Fishcer SG，Lerman LS.DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels：Correspondence with melting theory［J］.Proc.Natl.Acad.Sci，1983，80(6)：1579-1583.

［3］ Muyzer G，De Waal EC，Uitterlinden AG.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA［J］.Appl.envir.Microbiol.，1993，59(3)：695-700.

［4］ 徐大勇，黃為一.人工接種堆肥和自然堆肥微生物區(qū)系與分子多態(tài)性的變化［J］.生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2006，22(1)：29-33.

［5］ 李國(guó)媛，李俊，姜昕，等.應(yīng)用16S rDNA克隆文庫(kù)法分析有機(jī)物料腐熟菌劑細(xì)菌組成［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2007，34(5)：939-942.

［6］ 王小芬，高麗娟，楊洪巖，等.苜蓿青貯過程中乳酸菌復(fù)合系A(chǔ)12的接種效果及菌群的追蹤［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2007，23(1)：217-222.

［7］ 劉甲鋒，李力，陳慧君，等.水稻秸稈腐解復(fù)合菌系RSS-4的選育及其腐解特性［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2010，37(9)：1293-1298.

［8］ 劉甲鋒，沈德龍，李力，等.復(fù)合菌系RSS-4傳代對(duì)水稻秸稈腐解的影響［J］.微生物學(xué)雜志，2010，30(4)：30-35.

［9］ 高平平，趙立平.可用于微生物群落分子生態(tài)學(xué)研究的活性污泥總DNA提取方法研究［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，22(11)：2015-2019.

［10］ 李力.轉(zhuǎn)植酸酶基因膠凍樣芽胞桿菌(Bacillus mucilaginosus)NK-2的環(huán)境安全性及應(yīng)用效果研究［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2005.

［11］ Cahyani VR，Matsuya K，Asakawa S，et al.Succession and phylogenetic profile of eukaryotic communities in the composting process of rice straw estimated by PCR-DGGE analysis［J］.Biol Fertil Soils，2004，40(5)：334-344.

［12］ 余金勇，吳躍開.兩種產(chǎn)纖維素酶菌株分離的初步研究［J］.貴州林業(yè)科技，2006，34(4)：47-51.

［13］ 王嵐，江正強(qiáng)，楊紹青.嗜熱擬青霉產(chǎn)胞外木糖苷酶發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2007，34(3)：519-523.