汝?yáng)|宇,雷連成
(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室,吉林長(zhǎng)春130000)
狂犬病是由狂犬病病毒引起的人獸共患疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)告,全世界每年死于狂犬病的患者約55 000例,99%的病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家,其中亞洲約占全球狂犬病發(fā)病總數(shù)的56%,非洲約占發(fā)病總數(shù)的44%。其中印度發(fā)病人數(shù)最多,位居第一,我國(guó)次之[1-2]。人用狂犬病疫苗的免疫分為暴露前免疫及暴露后免疫,各國(guó)推薦使用的人用狂犬病疫苗免疫程序也不相同[3-4]。世界衛(wèi)生組織推薦的狂犬病毒暴露前免疫方案為0、7、21或28 d各免疫1劑量的疫苗,疫苗效力不低于2.5 IU/劑。暴露后免疫則有多種方案:埃森法(Essen regimen),第0、3、7、14和28天各肌肉注射1個(gè)劑量的疫苗(2.5 IU)。薩格勒布法(Zagreb regimen,2-1-1),第0天,分別在左和右上臂肌肉各注射1個(gè)劑量的疫苗,此后于第7和21天,各將1個(gè)劑量的疫苗注射至上臂,此種程序可免去2次就診和1劑疫苗。泰國(guó)紅十字會(huì)皮內(nèi)注射法(Thai Red Cross Schedule“2-2-2-1-1”法),第0、3、7天,在2個(gè)不同的淋巴引流區(qū)(通常為左、右上臂)皮內(nèi)注射1個(gè)劑量(0.1 mL)的疫苗,在第30和90天各注射0.1 mL疫苗。8部位皮內(nèi)注射法(8-0-4-0-1-1),第0天,在8個(gè)不同部位皮內(nèi)注射1個(gè)劑量疫苗(0.1 mL)。第7天,在每側(cè)上臂和每側(cè)大腿的外側(cè)皮內(nèi)注射4個(gè)0.1 mL的疫苗,此后,第28和90天各注射0.1 mL劑量的疫苗。上述各國(guó)應(yīng)用的人用狂犬病疫苗免疫方案均需接種4針次以上疫苗,全程免疫時(shí)間為21~90 d。在薩格勒布方案中,雖只接種4針,但在暴露后第3天沒(méi)有接種疫苗,而第3天對(duì)暴露后傷口的檢查是非常重要的。本文制備了一種高效價(jià)的凍干人用狂犬病疫苗,在高效價(jià)的基礎(chǔ)上,以減少狂犬病疫苗的免疫針次并縮短全程接種時(shí)間,對(duì)暴露后免疫程序進(jìn)行了初步研究。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠,雌性,11~13 g;比格犬,5~6 kg(上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,經(jīng)狂犬病毒抗體檢測(cè)為陰性)。
1.1.2 病毒和細(xì)胞狂犬病街毒株CNX8601(由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所提供,1986年分離自中國(guó)寧夏病人腦組織);狂犬病街毒株BD06(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所流行病學(xué)研究室提供);狂犬病病毒株CVS11;BSR細(xì)胞(由武漢生物制品研究所基因工程室提供)。
1.1.3 試劑和標(biāo)準(zhǔn)品人用狂犬病毒免疫球蛋白(21.4 IU/mL),購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;FITC標(biāo)記的抗狂犬病毒核蛋白熒光抗體(Chemico);胎牛血清、胰蛋白酶、牛血清白蛋白、谷氨酰胺、DMEM培養(yǎng)基(GIBCO);丙酮(北京化工廠);依文思藍(lán)(Sigma)。
1.1.4 實(shí)驗(yàn)樣品高效價(jià)凍干人用狂犬病疫苗(HPRabV),效價(jià)6.0 IU/劑,凍干人用狂犬病疫苗(RabV),效價(jià)3.1 IU/劑。
1.2.1 以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物HPRabV暴露后保護(hù)效果評(píng)價(jià)BALB/c小鼠,11~13 g,隨機(jī)分成3組,每組32只;狂犬病街毒株CNX8601,毒力為4.2 LgLD50,病毒采用30 LD50劑量接種于小鼠咬肌,接種病毒后2 h,腹腔免疫0.5 mL實(shí)驗(yàn)用疫苗。HPRabV(6.0 IU/劑)按0、3、14免疫程序免疫,RabV按0、3、7、14、28免疫程序免疫,設(shè)病毒對(duì)照組。于第5、7、10、14、18、22、26、33、37、44天于眼眶后靜脈采血,分離血清,采用RFFIT法測(cè)定血清中的中和抗體效價(jià)[5]。對(duì)HPRabV和RabV產(chǎn)生的中和抗體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每天觀察小鼠死亡情況,于第4天開(kāi)始記錄死亡的小鼠,根據(jù)病毒對(duì)照組死亡率及疫苗組的生存率計(jì)算HPRabV和RabV的保護(hù)率,并對(duì)兩者進(jìn)行評(píng)價(jià)。
1.2.2 以比格犬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物HPRabV暴露后保護(hù)效果評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為比格犬,體重5~6 kg,隨機(jī)分成4組,每組10只,每只均咬肌接種200 000 LD50狂犬病街毒BD06株,前腿肌肉注射HPRabV(效價(jià)6.0 IU/劑)或RabV(效價(jià)3.1 IU/劑),并設(shè)病毒對(duì)照組。免疫程序:①HPRabV于0、3、10 d各接種1劑量的疫苗;②HPRabV于0、3、14 d各接種1劑量的疫苗;③RabV于0、3、7、14、28 d各接種1劑量的疫苗;④病毒對(duì)照組。各組分別在5、7、10、14、18、22、26、33、37、44 d用注射器頸部靜脈取血1.0 mL,37℃放置1 h,4℃12 h,5 000 r/min離心10 min,吸取上層血清,56℃滅活30 min,利用RFFIT法檢測(cè)血清中的中和抗體效價(jià)。觀察并記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡情況,計(jì)算疫苗保護(hù)率。
以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的暴露后免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)中和抗體測(cè)定結(jié)果顯示,HPRabV 0/3/14同RabV 0/3/7/14/28比較,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05,2組之間相比有顯著性差異,HPRabV 0/3/14產(chǎn)生的中和抗體高于RabV 0/3/7/14/28組。
圖1 小鼠暴露街毒后接種HPRabV和RabV產(chǎn)生的中和抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.1 RVNA responses induced by HPRabV(6.0 IU/dose)and RabV(3.1 IU/dose)in BALB/c post exposure
小鼠咬肌接種狂犬病街毒CNX8601,劑量為30LD50,結(jié)果病毒對(duì)照組死亡率為93.8%,HPRabV組疫苗保護(hù)率為56.2%,RabV組的保護(hù)率為40.6%,結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 小鼠暴露狂犬病街毒后接種HPRabV及RabV的保護(hù)率Fig.2 Survival rate of BALB/c mice after post-exposure prophylaxis
利用RFFIT法檢測(cè)血清中的中和抗體效價(jià),計(jì)算各組中和抗體幾何平均效價(jià)(IU/mL),結(jié)果見(jiàn)圖3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,HPRabV 0/3/10組、HPRabV 0/3/14組與RabV 0/3/7/14/28組之間分別進(jìn)行中和抗體水平比較,經(jīng)t檢驗(yàn),P>0.05,不同免疫程序產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)均無(wú)顯著性差異。免疫后10 d前HPRabV組中和抗體水平明顯高于RabV組。第10天抗體檢測(cè),RabV組為23.8 IU/mL,HPRabV組為29.5 IU/mL和29.0 IU/mL,HPRabV組與RabV組分別進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.001,有極顯著性差異。同時(shí)第5、7天HPRabV組中和抗體水平均高于RabV組。HPRabV能夠更早的刺激機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的中和抗體。HPRabV 0/3/10組與HPRabV 0/3/14組間比較,兩者前期(0~18 d)中和抗體幾何平均效價(jià)基本持平,而后者在后期(22~56 d)中和抗體幾何平均效價(jià)均高于前者。
圖3 比格犬暴露后2種疫苗不同免疫程序產(chǎn)生的抗體效價(jià)比較Fig.3 RVNA responses induced by HPRabV and RabV in beagles post exposure prophy laxis
比格犬經(jīng)200 000 LD50狂犬病毒街毒株BD06攻擊后,2種不同效價(jià)疫苗的保護(hù)率結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn),病毒對(duì)照組死亡率為100%,表明比格犬街毒暴露后保護(hù)率試驗(yàn)結(jié)果成立。街毒攻擊后HPRabV 0/3/10免疫程序死亡3只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,疫苗保護(hù)率為70%;HPRabV 0/3/14免疫程序死亡2只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,疫苗保護(hù)率為80%;RabV 0/3/7/14/28免疫程序死亡3只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,疫苗保護(hù)率為70%。保護(hù)率試驗(yàn)結(jié)果表明HPRabV 0/3/10組、HPRabV 0/3/14組與RabV 0/3/7/14/28組街毒攻擊均具有保護(hù)作用,HPRabV 0/3/14組疫苗保護(hù)率高于其他2組。
圖4 街毒攻擊后2種疫苗不同免疫程序免疫比格犬保護(hù)率結(jié)果Fig.4 Survival rate of beagles after post-exposure prophylaxis
狂犬病疫苗主要應(yīng)用于暴露后免疫,WHO推薦使用的是埃森法,在0、3、7、14、28 d各免疫1個(gè)劑量的人用狂犬病疫苗,疫苗的效力不低于2.5 IU/劑,本研究制備的高效價(jià)凍干人用狂犬病疫苗(6.0 IU/劑)目標(biāo)是使暴露后免疫針次減少到3針,達(dá)到和現(xiàn)有疫苗同樣的保護(hù)效果。
以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的暴露后免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)中和抗體測(cè)定結(jié)果顯示,HPRabV 0/3/14同RabV 0/3/7/14/28比較,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05,2組之間相比有顯著性差異,HPRabV 0/3/14產(chǎn)生的中和抗體高于RabV 0/3/7/14/28組。并且2組的最高值均出現(xiàn)在18~22 d,2組產(chǎn)生的中和抗體水平消長(zhǎng)情況比較相似,是高效價(jià)凍干人用狂犬病疫苗比較理想的免疫程序。
在以比格犬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的暴露后免疫程序研究中,以BD06株作為攻擊用毒株,病毒對(duì)照組死亡率為100%,表明本次比格犬街毒暴露后保護(hù)率試驗(yàn)結(jié)果成立。HPRabV 0/3/10免疫程序疫苗保護(hù)率為70%;HPRabV 0/3/14免疫程序疫苗保護(hù)率為80%;RabV 0/3/7/14/28免疫程序疫苗保護(hù)率為70%。保護(hù)率試驗(yàn)結(jié)果表明HPRabV 0/3/10組、HPRabV 0/3/14組與RabV 0/3/7/14/28組街毒攻擊均具有保護(hù)作用,HPRabV 0/3/14組疫苗保護(hù)率高于其他2組。
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