陳雪峰，尹文翠

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安，710021)

發(fā)菜(Nostoc flagelliforme)是發(fā)狀念珠藻的簡(jiǎn)稱，隸屬藍(lán)藻門，主要生長(zhǎng)在干旱、半干旱地區(qū)的荒漠地帶，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的食用性藍(lán)藻［1］。發(fā)菜具有光合作用和固氮作用，是荒漠土壤中有機(jī)碳和氮的重要來(lái)源，對(duì)維持荒漠草原生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義。發(fā)菜生長(zhǎng)緩慢，自然資源非常有限，目前雖有關(guān)于發(fā)菜固體培養(yǎng)的研究報(bào)道［2］，但是發(fā)菜的大面積人工種植尚未成功實(shí)現(xiàn)。

本課題研究了一種較為簡(jiǎn)便的加速固體培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。選取粗沙、細(xì)沙和PA6三種不同的固體基質(zhì)材料，通過添加不同濃度的胞外多糖調(diào)節(jié)發(fā)菜細(xì)胞與固體材料的潤(rùn)濕性，來(lái)提高發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌在固體基質(zhì)上的的生長(zhǎng)速率，以期為發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌的大規(guī)模栽培奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)菜單體細(xì)胞

發(fā)菜采集于寧夏銀川賀蘭山東麓。將發(fā)菜原植體經(jīng)光合活性恢復(fù)，勻漿法分離單體細(xì)胞，純化后，收集細(xì)胞，重新懸浮于新鮮BG11培養(yǎng)基中，備用。

1.1.2 固體培養(yǎng)基質(zhì)

選取河沙(粗沙、細(xì)沙)和PA6不同潤(rùn)濕性的固體培養(yǎng)基［3］，用水洗滌干凈，烘干，添加量以平鋪至Ф90mm培養(yǎng)皿5mm高度為宜，即粗沙和細(xì)沙每培養(yǎng)皿用量60 g，PA6每培養(yǎng)皿30 g。

1.1.3 添加多糖

選用食用級(jí)的阿拉伯膠;食用級(jí)果膠;食用級(jí)海藻酸鈉。

1.2 方法

1.2.1 原料分級(jí)及粒度測(cè)量

河沙采用不同目數(shù)的泰勒標(biāo)準(zhǔn)篩進(jìn)行篩分，粒度小于32目的河沙收集后命名為細(xì)沙，粒度在5～14目的河沙收集后命名為粗沙。分別對(duì)細(xì)沙、粗沙和PA6固體基質(zhì)材料清洗直至清洗水透徹明亮，80℃烘干。

顯微鏡法是測(cè)定粒度分布最直觀的方法［4－5］，隨機(jī)選取少量3種材料，PA6材料為圓柱形，粒度用長(zhǎng)×寬表示，細(xì)沙和粗沙均屬于不規(guī)則形狀，粒度也用長(zhǎng)×寬表示。

1.2.2 發(fā)菜細(xì)胞的固體培養(yǎng)

固體基質(zhì)材料選用粗沙、細(xì)沙和PA6，培養(yǎng)液為BG110，收集發(fā)菜細(xì)胞，洗滌、離心后，用BG110稀釋，細(xì)胞濃度為A410=0.4左右。取5 mL稀釋液滴加于所有培養(yǎng)皿內(nèi)，并補(bǔ)加15 mL含有0.1%，0.3%，0.6%，1.0%的多糖培養(yǎng)液BG110，同等方法補(bǔ)加BG110培養(yǎng)液至15 mL作為空白對(duì)照，加蓋置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。光照強(qiáng)度90 μ/molm2s1，光暗比12∶12(白天從8∶00 －20∶00，夜晚20∶00 － 次日8∶00)，白天溫度25℃，夜晚10℃，每2～3天補(bǔ)少量水，使固體基質(zhì)材料表面保持濕潤(rùn)，每10天取樣測(cè)定生物量。

1.2.3 生物量的測(cè)定

采用葉綠素含量法間接測(cè)定發(fā)菜細(xì)胞生物量［6］，發(fā)菜細(xì)胞中的葉綠素含量計(jì)算［7］:

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次測(cè)定，采用SPSS 17.0軟件處理。數(shù)值采用均數(shù)(平均數(shù))±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，并作差異性分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同固體基質(zhì)材料平均粒度見表1。

2.1 固體基質(zhì)材料粒度

表1 不同固體基質(zhì)材料的平均粒度(單位:mm)

由表1可知，PA6平均粒度最大，粗沙次之，細(xì)沙最小。依據(jù)其粒度大小，3種固體材料屬于中等大小的顆粒。

2.2 粗沙上添加不同濃度多糖的發(fā)菜細(xì)胞生物量情況

以粗沙為固體基質(zhì)，在BG110培養(yǎng)液中分別添加阿拉伯膠、海藻酸鈉和果膠，設(shè)定多糖濃度均為0.1%、0.3%、0.6%、1.0%。培養(yǎng)一段時(shí)間(60天)，測(cè)定其生物量，以BG110為對(duì)照，進(jìn)行差異顯著性分析處理，其結(jié)果見表2。

表2 粗沙上添加多糖與BG110生物量的比較

由表2知，同一種多糖不同的濃度與對(duì)照組之間均有顯著性差異，均能顯著促進(jìn)發(fā)菜細(xì)胞生物量的提高。在多糖添加濃度為0.3%時(shí)，3種多糖對(duì)發(fā)菜細(xì)胞的促進(jìn)作用均最好，細(xì)胞生物量均達(dá)到最高，其中海藻酸鈉和果膠的促進(jìn)作用最大，阿拉伯膠次之。在多糖濃度為0.1%時(shí)，果膠促進(jìn)作用最好，海藻酸鈉次之，阿拉伯膠最小。在多糖濃度為0.6%時(shí)，果膠促進(jìn)作用最好，阿拉伯膠次之，海藻酸鈉最小。在多糖濃度為1.0%時(shí)，果膠促進(jìn)作用最好，阿拉伯膠和海藻酸鈉促進(jìn)作用次之。某一濃度下，3種多糖與對(duì)照組之間均有顯著性差異。結(jié)果表明，多糖之間，無(wú)論何種使用濃度，均以果膠的促進(jìn)作用為最好;濃度之間，均以0.3%添加量促進(jìn)作用最好。

圖1為粗沙上添加0.3%的多糖的發(fā)菜細(xì)胞生物量情況。從圖1可以看出，粗沙上發(fā)菜細(xì)胞均呈直線生長(zhǎng)。培養(yǎng)50天內(nèi)，0.3%的果膠對(duì)發(fā)菜細(xì)胞生物量的促進(jìn)作用明顯高于0.3%的海藻酸鈉和0.3%的阿拉伯膠。培養(yǎng)到60天時(shí)，0.3%的果膠和0.3%的海藻酸鈉對(duì)發(fā)菜細(xì)胞生物量的促進(jìn)作用基本相同，此時(shí)，發(fā)菜細(xì)胞生物量達(dá)(150.305±0.321)μg/培養(yǎng)皿，而對(duì)照組 BG110的生物量?jī)H為(125.471±0.321)μg/培養(yǎng)皿。20～40 d時(shí)，0.3%的阿拉伯膠和0.3%的海藻酸鈉對(duì)發(fā)菜細(xì)胞生物量的促進(jìn)作用基本一致。40天后，添加0.3%的海藻酸鈉的發(fā)菜細(xì)胞生物量迅速增加。

圖1 粗沙上添加0.3%多糖的發(fā)菜細(xì)胞生物量情況

2.3 細(xì)沙上添加不同濃度多糖的發(fā)菜細(xì)胞生物量情況

以細(xì)沙為固體基質(zhì)，在BG110培養(yǎng)液中分別添加阿拉伯膠、海藻酸鈉和果膠，設(shè)定多糖濃度均為0.1%、0.3%、0.6%、1.0%。培養(yǎng)一段時(shí)間(60天)時(shí)，測(cè)定其生物量，以BG110為對(duì)照，進(jìn)行差異顯著性分析處理，其結(jié)果見表3。

表3 細(xì)沙上添加多糖與BG110生物量的比較

由表3知，0.1%的阿拉伯膠和1.0%的阿拉伯膠之間沒有顯著性差異，海藻酸鈉和果膠的不同濃度與對(duì)照組之間均有顯著性差異。在多糖添加濃度為0.3%時(shí)，3種多糖對(duì)發(fā)菜細(xì)胞的促進(jìn)作用均最好，細(xì)胞生物量均達(dá)到最高，其中果膠的促進(jìn)作用最大，海藻酸鈉次之，阿拉伯膠最小。在多糖濃度為0.1%時(shí)，果膠促進(jìn)作用最好，海藻酸鈉次之，阿拉伯膠最小。在多糖濃度為0.6%時(shí)，果膠促進(jìn)作用最好，阿拉伯膠次之，海藻酸鈉最小。在多糖濃度為1.0%時(shí)，果膠促進(jìn)作用最好，阿拉伯膠次之，海藻酸鈉促進(jìn)作用最小。某一濃度下，3種多糖與對(duì)照組之間均有顯著性差異。結(jié)果表明，多糖之間，無(wú)論何種使用濃度，均以果膠的促進(jìn)作用為最好;濃度之間，均以0.3%添加量促進(jìn)作用最好。

圖2為細(xì)沙上添加0.3%的多糖的發(fā)菜細(xì)胞生物量情況。從圖2可以看出，細(xì)沙上發(fā)菜細(xì)胞也呈直線生長(zhǎng)，0～40 d內(nèi)，0.3%的果膠對(duì)發(fā)菜細(xì)胞生物量的促進(jìn)作用明顯好于0.3%的海藻酸鈉和0.3%的阿拉伯膠。10～30天時(shí)，0.3%的海藻酸鈉和0.3%的阿拉伯膠對(duì)發(fā)菜細(xì)胞生物量的促進(jìn)作用基本一致。40～60天時(shí)，0.3%的果膠對(duì)發(fā)菜細(xì)胞生物量的促進(jìn)作用略微高于0.3%的海藻酸鈉。培養(yǎng)到60 d時(shí)，添加0.3%果膠的發(fā)菜細(xì)胞生物量達(dá)(192.376±0.556)μg/培養(yǎng)皿;添加0.3%海藻酸鈉的發(fā)菜細(xì)胞生物量達(dá)(187.187±0.849)μg/培養(yǎng)皿，添加0.3%阿拉伯膠的發(fā)菜細(xì)胞生物量達(dá)(182.553±0.321)μg/培養(yǎng)皿，對(duì)照組 BG110的發(fā)菜細(xì)胞生物量為(160.869±0.321)μg/培養(yǎng)皿。與圖1相比，細(xì)沙上的發(fā)菜細(xì)胞生物量高于粗沙上的發(fā)菜細(xì)胞生物量。

圖2 細(xì)沙上添加0.3%多糖的發(fā)菜細(xì)胞生物量情況

2.4 PA6上添加不同濃度多糖的發(fā)菜細(xì)胞生物量情況

以PA6為固體基質(zhì)，在BG110培養(yǎng)液中分別添加阿拉伯膠、海藻酸鈉和果膠，設(shè)定多糖濃度均為0.1%、0.3%、0.6%、1.0%。培養(yǎng)一段時(shí)間(60天)時(shí)，測(cè)定其生物量，以BG110為對(duì)照，進(jìn)行差異顯著性分析處理，其結(jié)果見表4。

表4 PA6上添加多糖與BG110生物量的比較

由表4知，同一種多糖不同的濃度與對(duì)照組之間均有顯著性差異，均能顯著促進(jìn)發(fā)菜細(xì)胞生物量的提高。在多糖添加濃度為0.3%時(shí)，3種多糖對(duì)發(fā)菜細(xì)胞的促進(jìn)作用均最好，細(xì)胞生物量均達(dá)到最高，其中果膠和海藻酸鈉的促進(jìn)作用最大，阿拉伯膠次之。在多糖濃度為0.1%時(shí)，果膠和海藻酸鈉促進(jìn)作用最好，阿拉伯膠次之。在多糖濃度為0.6%時(shí)，果膠促進(jìn)作用最好，阿拉伯膠和海藻酸鈉次之。在多糖濃度為1.0%時(shí)，3種多糖對(duì)發(fā)菜細(xì)胞的促進(jìn)作用均最小，其中果膠促進(jìn)作用最好，海藻酸鈉次之，阿拉伯膠促進(jìn)作用最小。某一濃度下，3種多糖與對(duì)照組之間均有顯著性差異。結(jié)果表明，多糖之間，無(wú)論何種使用濃度，均以果膠的促進(jìn)作用為最好;濃度之間，均以0.3%添加量促進(jìn)作用最好。

圖3為PA6上添加0.3%的多糖的發(fā)菜細(xì)胞生物量情況。從圖3可以看出，PA6上發(fā)菜細(xì)胞也呈直線生長(zhǎng)，但趨勢(shì)比較緩慢。培養(yǎng)60天內(nèi)，0.3%的果膠和0.3%的海藻酸鈉對(duì)發(fā)菜細(xì)胞生物量的促進(jìn)作用明顯好于0.3%的阿拉伯膠;但是0.3%的果膠和0.3%的海藻酸鈉的促進(jìn)作用基本一致。0～30天內(nèi)，0.3%的海藻酸鈉對(duì)發(fā)菜細(xì)胞生物量的促進(jìn)作用略微高于0.3%的果膠，40～50天內(nèi)，0.3%的果膠對(duì)發(fā)菜細(xì)胞生物量的促進(jìn)作用略微高于0.3%的海藻酸鈉，培養(yǎng)到60天時(shí)，兩者之間的生物量基本相同(添加0.3%果膠的發(fā)菜細(xì)胞生物量達(dá)121.579±0.321μg/培養(yǎng)皿，添加0.3%海藻酸鈉的發(fā)菜細(xì)胞生物量達(dá)121.023±0.321μg/培養(yǎng)皿)。與圖1和圖2相比，固體基質(zhì)PA6上的發(fā)菜細(xì)胞生物量明顯低于細(xì)沙和粗沙上的發(fā)菜細(xì)胞生物量。

圖3 PA6上添加0.3%多糖的發(fā)菜細(xì)胞生物量情況

3 討論

對(duì)于固體材料來(lái)說，細(xì)小的顆粒具有較大的比表面積，容易與各種物質(zhì)相互結(jié)合與吸附。另一方面，固體顆粒粒徑越小，堆積密度越大，相同體積下堆積的固體顆粒越多，因此顆粒與顆粒之間的空隙越小。在固體顆粒堆積的層面上進(jìn)行發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，空隙越小，毛細(xì)作用越強(qiáng)，從而利于底部水分的輸送，滿足發(fā)菜細(xì)胞對(duì)水分的需求，從這一角度考慮，有利于發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)的固體基質(zhì)材料依次為細(xì)沙＞粗沙＞PA6。另外，固體材料的親水性、疏水性也非常重要［8］，沙石的接觸角為 22.4°，PA6 的接觸角為44.7°，3種固體基質(zhì)材料都具有一定親水性，并且沙粒的親水性高于 PA6［9］，從親水性上來(lái)說，沙粒比PA6更有利于發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng)。這與實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照結(jié)果相符合。

實(shí)驗(yàn)過程中，添加3種多糖均能提高發(fā)菜細(xì)胞生物量，其中添加果膠最有利于發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng)，海藻酸鈉次之，阿拉伯膠的作用最小。這主要是因?yàn)楣z的結(jié)構(gòu)是由多聚半乳糖醛酸α-1，4苷鍵連成的直鏈，含有大量親水性的羧基和羥基，在水中可形成一種帶負(fù)電荷的粘性膠體溶液，隨著果膠的加入，提高了固體基質(zhì)表面的親水性［10］，使得固體基質(zhì)之間的潤(rùn)濕狀況變得最好，有利于發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng);海藻酸鈉主要由古洛糖醛酸和立體異構(gòu)體甘露糖醛酸兩種結(jié)構(gòu)單元組成，分子量在36萬(wàn)左右，結(jié)構(gòu)中含有大量的羥基和－COONa，在添加多糖量相同的情況下，海藻酸鈉的親水性基團(tuán)略少于果膠;阿拉伯膠結(jié)構(gòu)的中央是以β-1，3鍵相連的半乳聚糖，L-鼠李糖分布在結(jié)構(gòu)的外表，鼠李糖的碳六位上是CH3［11］，阿拉伯膠的結(jié)構(gòu)上還連有2%左右的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的親水性小于多糖類，這可能會(huì)導(dǎo)致阿拉伯膠的親水性不及果膠和海藻酸鈉，致使添加阿拉伯膠的發(fā)菜細(xì)胞生物量小于添加海藻酸鈉和果膠的發(fā)菜細(xì)胞生物量。

另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多糖的添加量并非越多越好，0.3%的多糖添加量為最宜，超過0.3%后，發(fā)菜細(xì)胞生物量反而會(huì)減少。這是因?yàn)槎嗵堑臐舛仍礁?，發(fā)菜細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的滲透壓就越大，為使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓相等，發(fā)菜細(xì)胞內(nèi)水分子會(huì)向細(xì)胞外移動(dòng)，這就導(dǎo)致發(fā)菜細(xì)胞脫水，從而不利于發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng)，使發(fā)菜細(xì)胞生物量減少。在發(fā)菜細(xì)胞生長(zhǎng)過程中，加入多糖是為了幫助細(xì)胞從周圍環(huán)境吸附水，但多糖的添加量過高，也會(huì)導(dǎo)致環(huán)境滲透壓過高引起細(xì)胞失水，由此說明，在發(fā)菜細(xì)胞固體培養(yǎng)過程中，為了改善發(fā)菜細(xì)胞水分的供給，多糖的添加量要控制在適中水平。

總之，發(fā)菜細(xì)胞在固體培養(yǎng)過程中，通過添加多糖可以改變細(xì)胞與固體依附基質(zhì)表面之間的潤(rùn)濕性，調(diào)節(jié)細(xì)胞從周圍環(huán)境獲取水分的供需狀況，有利于發(fā)菜在干旱環(huán)境中的生長(zhǎng)，從而提高發(fā)菜的生長(zhǎng)速率，但其添加量要控制在合適水平。

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