戚建華，姚增玉，，王力華

1(西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明，650224)2(中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽，110016)

顏色是食品感官質(zhì)量最重要的屬性［1］。近年來人們越來越關(guān)注合成色素的安全性問題，天然食品色素的需求越來越高。我國是栗子生產(chǎn)第一大國，2009年產(chǎn)量約為109萬t［2］。栗子殼為栗子深加工過程中產(chǎn)生的廢棄物，含有棕色的色素——栗子殼色素。國內(nèi)外學(xué)者對栗子殼色素的提取工藝、穩(wěn)定性、抗氧化活性、抑菌活性、印染性能和食品著色性能等方面進(jìn)行了研究，取得了一些成果［3］。栗子殼色素的提取依據(jù)所用溶劑不同大體可以分為2類:堿性水溶液提取(堿提法)［4-5］和乙醇水溶液提取(醇提法)［6-7］。堿提法較醇提法色素得率高，但得到的栗子殼色素的溶解性能較差，在中性和酸性水溶液中以及醇溶液中只有其中很少的一部分能夠溶解，因此應(yīng)用范圍受到限制。栗子殼色素屬于黑色素(melanin)，是一類由酚類物質(zhì)氧化聚合而成的高分子物質(zhì)［8］。由于黑色素為非均勻性無定形物質(zhì)，水合后呈膠狀，且一般在生物體內(nèi)與蛋白質(zhì)、糖類、脂類等物質(zhì)結(jié)合在一起，因此無法通過重結(jié)晶或通常的色譜、電泳等方法進(jìn)行分離純化［9］。黑色素為腐殖質(zhì)的類似物，國外有些研究腐殖質(zhì)的學(xué)者曾將黑色素歸為活體生物中的腐殖質(zhì)，并采用對土壤腐殖質(zhì)進(jìn)行分級和精制的方法來對來自活體生物中的腐殖質(zhì)(黑色素)進(jìn)行分級和精制［10］。本研究以此法為基礎(chǔ)，根據(jù)溶解性的差異對堿提栗子殼色素進(jìn)行了分級和精制。與人工合成色素相比，天然色素一般易受光照、溫度、pH值、氧化劑和其他一些因素影響，因此本研究還對得到的栗子殼色素的各個(gè)分級組分的穩(wěn)定性進(jìn)行了比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料

栗子(Castanea mollissima)購自沈陽當(dāng)?shù)厥袌?，手工剝?nèi)±踝託ぃ谜麴s水洗去栗子殼上黏著的灰塵和殘余果肉，然后在60℃烘24 h，粉碎后過0.25 mm篩備用;XAD-8大孔吸附樹脂購自Sigma公司(美國);實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 栗子殼色素的提取與分級

栗子殼色素的提取與分級按照圖1所示流程進(jìn)行。

1.2.1 栗子殼色素的提取與游離蛋白的脫除

稱取60 g栗子殼放入1 L燒瓶中，加入900 mL 0.5 mol/L的NaOH水溶液，置于40℃水浴中提取36 h后用棉布粗濾，濾液于5 000 g離心30 min。離心上清液采用Sevag法脫除上清液中游離蛋白5次。

1.2.2 栗子殼色素的分級與精制

栗子殼色素的分級與精制按照以下步驟進(jìn)行:

(1)將脫除游離蛋白后的栗子殼色素粗提液置于燒杯中以2 mol/L的HCl調(diào)節(jié)至pH 2，靜置12 h后以5 000 g離心15 min，分別收集沉淀和上清液，沉淀加蒸餾水并以NaOH調(diào)節(jié)溶液酸堿度至pH 10～11，使色素重新溶解，離心棄去不溶部分，上清液調(diào)節(jié)至pH值為2，靜置12 h后離心并分別收集上清液和沉淀。如此反復(fù)溶解、沉淀數(shù)次，至pH為2時(shí)上清液接近無色。

圖1 栗子殼色素提取、分級和精制流程

(2)沉淀用乙醇反復(fù)洗滌至上清液無色，分別收集沉淀和乙醇溶液。不溶于乙醇的部分先后用乙酸乙酯和丙酮反復(fù)洗滌以除去脂溶性成分，最后于60℃下干燥得到色素分級組分Fr.1。

(3)步驟(2)中收集的乙醇溶液中仍然含有色素，向該溶液中加入2倍于乙醇體積的石油醚以使色素沉淀并離心收集，然后用乙醇重新將色素溶解并離心，棄去不溶部分，上清液重新加入石油醚使之沉淀，如此反復(fù)3次，以除去脂溶性成分，最后60℃下干燥得到色素分級組分Fr.2。

(4)步驟(1)中酸化至pH 2后離心上清液中仍然含有色素，將其通過XAD-8大孔吸附樹脂柱，然后先用3倍于柱體積的pH值為2的水(用HCl調(diào)節(jié))洗柱，再用去離子水沖洗至洗出液Cl-定性檢測反應(yīng)為陰性(加入AgNO3洗出液不出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象)，最后改用乙醇將色素洗脫下來。洗脫液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，然后用無水乙醇重新溶解，加入約2倍體積的石油醚，使色素沉淀，如此反復(fù)沉淀3次，以除去脂溶性成分，最后60℃下干燥得到色素分級組分Fr.3。

1.3 栗子殼色素分級組分的溶解性分析

在各個(gè)試管中加入0.01 g栗子殼色素分級組分，然后向各試管中分別加入10 mL濃度為1 mol/L的 NaOH、Na2CO3、NaHCO3、NH4OH、HCl水溶液或蒸餾水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、乙醚、石油醚、正己烷，加蓋后室溫下放置24 h，期間搖動數(shù)次，觀察溶液層顏色。

1.4 栗子殼色素分級組分溶液的配制

將100 mg栗子殼色素分級組分用10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2% 的氨水在N2保護(hù)下溶解，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓抽去多余氨氣，直至pH值達(dá)7.5，最后用去離子水稀釋至所需濃度。

1.5 栗子殼色素分級組分的化學(xué)定性分析

三氯化鐵-鐵氰化鉀試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)、鹽酸-鋅粉試驗(yàn)、三氯化鋁熒光試驗(yàn)等化學(xué)定性分析參照文獻(xiàn)［11］進(jìn)行。

1.6 栗子殼色素分級組分的紫外-可見光光譜分析

紫外-可見光光譜用UV-2102 PCS分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司，上海)分析。栗子殼色素分級組分溶液濃度為20 mg/L，掃描范圍為200～800 nm。

1.7 栗子殼色素分級組分的穩(wěn)定性分析

(1)對pH的穩(wěn)定性:將栗子殼色素分級組分溶液用NaOH或HCl調(diào)至不同的pH值，測定400 nm處的吸光度。

(2)對蔗糖的穩(wěn)定性:4.5 mL 100 mg/L的栗子殼色素分級組分溶液與0.5 mL不同濃度的蔗糖溶液混合，使混合液中蔗糖的濃度分別為0.01、0.1和1 mg/L，在室溫下放置12 h后測定400 nm處的吸光度。

(3)對溫度的穩(wěn)定性:取100 mg/L的栗子殼色素分級組分溶液各9份，每份5 mL，裝入15 mL具塞試管中，加蓋后分為3組，分別置于25、60和100℃水浴中。分別于0.5、1.5和3 h從每個(gè)水浴鍋中取出1支試管立即用自來水冷卻，測定400 nm處吸光度。

(4)對光照的穩(wěn)定性:取100 mg/L的栗子殼色素分級組分溶液20 mL，置于直徑90 mm的培養(yǎng)皿中敞口置于距紫外燈管30 cm處進(jìn)行照射，分別于0、0.5、1.5、3.5 h取出3.5 mL在400 nm波長下測其吸光度。取100 mg/L的栗子殼色素分級組分溶液2份，每份50 mL，分別置于50 mL具塞三角瓶中，其中1份用黑布包裹，另1份不包裹，將它們同時(shí)置于室內(nèi)自然光下，分別于5、10、15、30 d各取出3.5 mL在400 nm波長下測其吸光度。

(4)對氧化劑和還原劑的穩(wěn)定性:100 mg/L的栗子殼色素分級組分溶液4.5 mL與0.5 mL不同濃度的Na2S2O3混合，使混合液中Na2S2O3的濃度分別為0.01、0.1和1 mg/L，在室溫下放置12 h后測定400 nm處的吸光度。以H2O2代替Na2S2O3研究氧化劑對栗子殼色素分級組分穩(wěn)定性的影響。

(5)對金屬離子的穩(wěn)定性:以金屬的鹽酸鹽配制濃度為 0.1、1 和 10 mmol/L 的 Na+、Mg2+、Al3+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+和 Zn2+溶液。4.5 mL 100 mg/L的栗子殼色素分級組分溶液與0.5 mL金屬離子溶液混合，在室溫下放置12 h后觀察有無沉淀產(chǎn)生，并測定未形成沉淀的色素溶液400 nm處的吸光度。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

每一個(gè)處理獨(dú)立重復(fù)3次，文中數(shù)據(jù)表示為3次重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(S.E.)。

2 結(jié)果與討論

2.1 栗子殼色素分級組分的溶解性

3種栗子殼色素分級組分均溶于堿性水溶液，而不溶于乙酸乙酯、三氯甲烷、乙醚、石油醚和正己烷等親脂性有機(jī)溶劑。Fr.1在中性和酸性水中以及親水性有機(jī)溶劑甲醇、乙醇和丙酮中都不溶解，F(xiàn)r.3在這些溶劑中都能溶解，而Fr.2溶于親水性有機(jī)溶劑甲醇、乙醇和丙酮但不溶于中性和酸性水。堿提栗子殼色素溶解性較差，在中性和酸性水溶液以及親水性有機(jī)溶劑中只有很少的一部分能夠溶解，限制了其應(yīng)用范圍，本研究將其分級為3種溶解性不同的組分，F(xiàn)r.1適合在堿性條件下使用，F(xiàn)r.2在堿性條件下以及酒精飲料中均可使用，F(xiàn)r.3使用范圍最廣，除了適于堿性條件和酒精飲料外，還可在中性和酸性(如酸性飲料)條件下使用，在應(yīng)用中可根據(jù)不同要求選擇合適的分級組分，從而拓寬了栗子殼色素的應(yīng)用范圍。

2.2 栗子殼色素分級組分的化學(xué)定性

三氯化鐵-鐵氰化鉀反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種栗子殼色素分級組分均含有酚羥基;各分級組分均不能使氯化鈉-明膠溶液產(chǎn)生沉淀，不具鞣性;鹽酸鋅粉試驗(yàn)陰性且三氯化鋁反應(yīng)未觀察到熒光，說明3種栗子殼色素分級組分均不具有典型黃酮類色素性質(zhì)。李云雁和宋光森［12-13］與段蕊等［14］初步研究后得出結(jié)論:栗子殼色素具有典型的黃酮類化合物性質(zhì)，且含有單寧類化合物;而李永祥等［11］的研究則證明，初步精制的栗子殼色素雖然含有酚羥基但并非黃酮類化合物，也非單寧。本研究與李永祥等［11］的研究結(jié)果基本一致。不同學(xué)者得到不同甚至相左的結(jié)論，可能是由于色素的精制程度不同而引起的，在栗子殼色素粗提液中可能含有黃酮類化合物和單寧。

2.3 栗子殼色素分級組分的紫外-可見光光譜

3種栗子殼色素分級組分均具有黑色素紫外-可見光光譜的典型特征，其譜圖都是隨著波長增大而逐漸減小的曲線，在可見光區(qū)沒有明顯的吸收峰，僅在270 nm左右有一肩峰。生物體合成的黑色素通常在270～280 nm處存在肩峰或小的吸收峰，而人工合成黑色素則無此特征［14］，因而該峰被認(rèn)為是由結(jié)合于黑色素上的蛋白質(zhì)中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸中的苯環(huán)引起的。400～600 nm內(nèi)的吸光度取對數(shù)后與相應(yīng)波長呈負(fù)線性關(guān)系，其斜率通常作為表征黑色素的參數(shù)，F(xiàn)r.1、Fr.2和Fr.3的斜率分別為-0.005 4、-0.005 0和-0.004 6(圖略)，與其他黑色素類似，例如:合成多巴黑色素(-0.006 4)［15］和茶葉黑色素(-0.001 9)［16］。以往的報(bào)道［11］中，栗子殼色素在紫外區(qū)和可見光區(qū)均有吸收峰，可能與其精制程度低有關(guān)。

圖2 栗子殼色素的紫外-可見光光譜

2.4 pH值對栗子殼色素分級組分的影響

3種栗子殼色素分級組分溶液的顏色均隨著pH值的增大而逐漸加深，從黃棕色或紅棕色逐漸變?yōu)榧t褐色，與其他2個(gè)分級組分相比，F(xiàn)r.2顏色偏紅，相同pH值下顏色最深。栗子殼色素同可可色素都屬于棕色色素系列，且其紫外光譜也非常相似，都在可見光區(qū)沒有吸收峰，是一條隨波長增加而吸光度減小的曲線［17-19］。國家標(biāo)準(zhǔn)中以400 nm作為測定可可色素色價(jià)的波長［18］，因此本研究以400 nm處的吸光度作為評價(jià)栗子殼色素分級組分穩(wěn)定性的指標(biāo)。從圖3同樣可以看出，3種栗子殼色素溶液的顏色隨著pH增加而加深，這種顏色的變化是由于色素中存在大量的酸性官能團(tuán)，如羧基、酚羥基等，這些官能團(tuán)的解離而改變了共軛情況，從而導(dǎo)致顏色發(fā)生變化。

圖3 溶液pH值對栗子殼色素分級組分400 nm處吸光度的影響

2.5 蔗糖對栗子殼色素分級組分的影響

栗子殼色素分級組分溶液中加入蔗糖前后的吸光度如圖4所示，在加入蔗糖后各色素分級組分的吸光度沒有明顯變化，說明蔗糖對3種色素溶液沒有明顯影響。

圖4 蔗糖對栗子殼色素分級組分400 nm處吸光度的影響

2.6 溫度對栗子殼色素分級組分的影響

在室溫下栗子殼色素分級組分保持穩(wěn)定，隨著時(shí)間延長，其吸光度變化不大，但加熱可使栗子殼色素各分級組分的吸光度增大，且隨著溫度的升高而更為明顯(圖5)。Fr.3對熱最為敏感，加熱后吸光度增加幅度最大，而Fr.1相對較為穩(wěn)定，吸光度增加量較小。

圖5 栗子殼色素的熱穩(wěn)定性

2.7 光照對栗子殼色素分級組分的影響

在紫外光照射下3種栗子殼色素分級組分的吸光度均增大，F(xiàn)r.1增幅最小，而Fr.3增幅最大(圖6-A)。從圖6-B可以看出，在黑暗條件下Fr.1吸光度先下降后又略有上升，但自然光照條件下吸光度的下降幅度比黑暗下更多，且在試驗(yàn)時(shí)間范圍內(nèi)表現(xiàn)為持續(xù)下降，因此可以認(rèn)為自然光照對Fr.1具有褪色作用;對于Fr.2和Fr.3，黑暗放置亦可使吸光度升高，但其幅度不及自然光照條件下，說明自然光對這2種色素具有增色作用。

圖6 紫外線(A)和自然光(B)對栗子殼色素400 nm吸光度的影響

2.8 氧化劑和還原劑對栗子殼色素分級組分的影響

在栗子殼色素分級組分溶液中加入不同濃度的H2O2或Na2S2O3，其吸光度變化如圖7所示。

圖7 氧化劑和還原劑對栗子殼色素400 nm吸光度的影響

由圖7可以看出，3種色素組分均可被H2O2氧化褪色，與李永祥等［11］的研究結(jié)果一致，但張捷莉等［19］研究表明，栗子殼色素對H2O2比較穩(wěn)定，這可能是他們所用的栗子殼色素未經(jīng)純化，其中含有一些還原性更強(qiáng)的雜質(zhì)，保護(hù)栗子殼色素未受H2O2氧化褪色。還原劑Na2S2O3對色素沒有明顯影響，說明3種栗子殼色素均具有一定的還原性。

2.9 金屬離子對栗子殼色素分級組分的影響

在栗子殼色素分級組分溶液中加入不同的金屬離子后，其吸光度變化如圖8所示。3種色素組分在加入Na+或Mg2+后吸光度沒有顯著變化。低濃度的Al3+、Ca2+、Fe2+、Fe3+和 Cu2+可使各分級組分的吸光度增大，而高濃度時(shí)發(fā)生沉淀，加入Al3+或Cu2+形成的沉淀為棕色絮狀，加入Fe2+或Fe3+形成的沉淀為污黑色絮狀。Zn2+的加入使3種分級組分的吸光度均增大，且高濃度可使Fr.1產(chǎn)生棕色沉淀。說明3種栗子殼色素分級組分均對Na+和Mg2+穩(wěn)定而對Al3+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+和 Zn2+不穩(wěn)定，可能是這些金屬離子更容易與色素中的羥基、羧基等官能團(tuán)絡(luò)合。

圖8 金屬離子對栗子殼色素400 nm吸光度的影響

3 結(jié)論

本研究根據(jù)溶解性不同，將栗子殼色素分級得到3種色素組分Fr.1、Fr.2和Fr.3。Fr.1只溶于堿性水溶液，適合在堿性條件下使用;Fr.2溶于堿性水溶液和甲醇、乙醇、丙酮等親水性有機(jī)溶劑，在堿性條件下以及酒精飲料中均可使用;Fr.3溶在任何pH值的水溶液中都能溶解，在親水性有機(jī)溶劑中也能溶解，除了適于堿性條件和酒精飲料外，還可在中性和酸性(如酸性飲料)條件下使用。本研究提供了一種新的、較為簡單和廉價(jià)的對栗子殼色素進(jìn)行分級和精制的方法，在應(yīng)用中可根據(jù)不同要求選擇合適的分級組分，從而拓寬了栗子殼色素的應(yīng)用范圍。

對3種栗子殼色素分級組分的穩(wěn)定性進(jìn)行了比較研究，各組分的溶液顏色均隨著pH值的增大而逐漸加深，在相同濃度和pH值下，F(xiàn)r.2溶液偏紅，顏色最深。加熱和紫外線對栗子殼色素具有增色效應(yīng)，F(xiàn)r 1對加熱和紫外線相對較為穩(wěn)定，而Fr.3最為敏感。氧化劑可使各栗子殼色素分級組分褪色，且Fr.1褪色幅度最大，F(xiàn)r.2最小。各色素組分對還原劑都較為穩(wěn)定。3種色素組分均對Na+和Mg2+穩(wěn)定而對Al3+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+和 Zn2+不穩(wěn)定。蔗糖對栗子殼色素沒有顯著影響。在食品加工過程中使用栗子殼色素作為著色劑時(shí)可根據(jù)加工工藝、包裝、儲存和運(yùn)輸條件等等選擇合適的分級組分。

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