王穎，邱璠，邢茜，殷麗君

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)

生物胺是一類堿性含氮化合物，作為人體內(nèi)正常的生理活性物質(zhì)在細(xì)胞中具有重要的生理功能。當(dāng)人體內(nèi)生物胺含量過(guò)多時(shí)，會(huì)刺激體內(nèi)釋放腎上腺素和去甲腎上腺素，增加胃酸分泌，引起心跳過(guò)速、偏頭痛、血糖升高和血壓升高［1－3］。生物胺的形成主要有2種形式:一種是通過(guò)氨基酸的脫羧作用，另一種是通過(guò)醛酮類化合物的氨基化或轉(zhuǎn)氨作用形成［4］。生物胺產(chǎn)生的條件有3個(gè):①有可形成生物胺的游離氨基酸，②存在可代謝產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物，③適合該微生物生長(zhǎng)的環(huán)境［5］。

食品中主要存在的生物胺包括組胺、腐胺、尸胺、酪胺、色胺、β－苯乙胺、精胺和亞精胺［5］。目前關(guān)于食品中生物胺的研究主要是針對(duì)魚(yú)及魚(yú)制品、肉及肉制品、香腸、奶酪、啤酒、紅酒、發(fā)酵蔬菜等食品［4－8］，在未發(fā)酵的食品中，如魚(yú)、肉等，生物胺的產(chǎn)生多是由微生物污染引起的，因此把生物胺作為食品腐敗變質(zhì)的指標(biāo)之一;而在發(fā)酵食品，尤其是蛋白質(zhì)和氨基酸含量高的食品中，由于微生物的作用，生物胺含量相對(duì)較高。Mohamed等［9］研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵魚(yú)制品 Feseekh在成熟過(guò)程中，生物胺總量從83.63 mg/kg干基增長(zhǎng)到608.72 mg/kg干基，經(jīng)過(guò)60天儲(chǔ)藏后達(dá)到1633.02 mg/kg干基。Favaro等［10］檢測(cè)到鮮肉中只含有少量的酪胺、亞精胺和精胺，其他種類生物胺未檢出;而在發(fā)酵香腸和干腌制品中，主要含有酪胺(104～295 mg/kg)、腐胺(97～331 mg/kg)和尸胺(6～81 mg/kg)。

腐乳是我國(guó)傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品之一，是以大豆為主要原料，經(jīng)過(guò)磨漿、成坯、前酵、腌制、后酵等過(guò)程制作而成的富含大豆蛋白的發(fā)酵制品。腐乳口感細(xì)膩，營(yíng)養(yǎng)豐富，有“東方奶酪”之稱，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。隨著對(duì)食品安全重視程度的增加，腐乳作為蛋白質(zhì)和氨基酸含量較高的發(fā)酵食品，存在生成生物胺的可能性，而目前關(guān)于傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品中生物胺的研究還很少，因此有必要對(duì)腐乳發(fā)酵過(guò)程中生物胺的產(chǎn)生情況進(jìn)行分析。本課題主要研究了腐乳前酵過(guò)程中生物胺含量的變化。

1 材料與方法

1.1 原料

大豆，中黃13號(hào)，由北京中農(nóng)作科技發(fā)展有限公司提供。

1.2 菌種

雅致放射毛霉Actinomucor elegans(王致和腐乳廠)，少孢根霉Rhizopus oligosporus(中科院微生物研究所)。

1.3 主要試劑

HCl，氨水，丙酮，NaOH，NaHCO3，MgCl2，均為分析純。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品

色 胺 (98%)Sigma-Alorich INC，β-苯 乙 胺(97.5%)Dr Ehrenstorfer GmbH，腐胺(99%)Dr Ehrenstorfer GmbH，尸胺(99%)Dr Ehrenstorfer GmbH，鹽酸組胺(99%)TCI東京化成工業(yè)株式會(huì)社，酪胺(＞98%)(TCI(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，＞98%)，亞精胺 (99%)、精 胺 (97%)，丹磺酰氯(97%)Alfa Aesar。

1.5 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀(SHIMADZU，10A)，真空冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠，LCJ-10)，冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，GL-20G-II)，均質(zhì)機(jī)(IKA LABORTECHNIK，T25 basic)，電泳儀(AZZO，AE-8450)

1.6 方法

1.6.1 菌種的活化

將菌種劃線于PDA培養(yǎng)基斜面上，28℃活化72 h。

1.6.2 孢子懸浮液的制備

將麩皮與水按1∶1.4(g∶mL)混合，置于250 mL三角瓶中，于121℃滅菌20 min，冷卻后分別接種雅致放射毛霉、少孢根霉，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)3d。加入適量生理鹽水，充分搖動(dòng)，分別得到雅致放射毛霉孢子懸浮液和少孢根霉孢子懸浮液。鏡檢計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為107個(gè)孢子/mL。孢子懸浮液隨用隨配，不做儲(chǔ)藏。

1.6.3 腐乳白坯的制作

挑選顆粒飽滿的大豆300 g，以1 200 mL去離子水室溫浸泡12 h。待大豆泡好后，以1 800 mL水為溶劑，用磨漿機(jī)磨成豆?jié){。過(guò)100目篩，加熱，95℃保溫5 min，冷卻至80℃，保溫5 min，手動(dòng)攪拌加入100 mL 1 mol/L MgCl2溶液點(diǎn)漿，80℃蹲腦40 min，壓榨成型，最后將豆腐切成塊。

1.6.4 腐乳前酵

將豆腐坯整齊的擺入蒸籠中，將制備好的孢子懸浮液均勻噴灑在腐乳白坯表面，平均每塊豆腐坯噴灑1 mL孢子懸浮液。豆腐坯之間間隔為1cm。雅致放射毛霉在28℃，相對(duì)濕度88%的條件下進(jìn)行發(fā)酵，少孢根霉在32℃，相對(duì)濕度88%的條件下進(jìn)行發(fā)酵，并于24、36、48、60、72h 時(shí)取樣。

1.6.5 腐乳樣品稀釋液的制備

取凍干的腐乳樣品2.5g于離心管中，加15 mL 0.1 mol/L HCl，均質(zhì) 2 min，4℃15 800 × g離心 20 min，取上清液，過(guò)濾，取1 mL濾液定容到5 mL，得到樣品稀釋液，取1 mL進(jìn)行衍生，作2個(gè)平行。

1.6.6 樣品衍生［11］

取1 mL上述腐乳樣品稀釋液，依次加入200 μL 2 mol/L NaOH、300 μL 飽和 NaHCO3、2 mL 丹磺酰氯(DCl)(10 mg/mL 丙酮)，40℃ 暗處理 45 min，加入100 μL 25% 氨水，靜置 30 min，乙腈定容到 5 mL，0.45μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，備用(4℃避光保存)。

1.6.7 HPLC分析

1.6.7.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別稱取50 mg(精確到0.0001 g)生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1 mmol/L HCl定容到50 mL，制成標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，各取儲(chǔ)備液10 mL混合后定容到100 mL，制成標(biāo)準(zhǔn)品混合液，再用0.1 mmol/L HCl將混合液分別稀釋到 100、50、25、10、5 μg/mL。將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合液進(jìn)行衍生，方法同樣品衍生1.6.6。

1.6.7.2 高效液相色譜檢測(cè)條件

色譜柱:C18柱(4.6 mm ×250 mm，5μm)，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫40℃，流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈，流速為0.8 mL/min，梯度洗脫程序如下:

時(shí)間/min A濃度/% B濃度/%0.01 35 65 1 35 65 10 20 80 15 10 90 25 10 90 30 35 65

1.7 多肽測(cè)定［12］

參照Church F．C．的方法有所改動(dòng)。OPA試劑的配制:取50 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液，5 mL 0.2 g/mL SDS 溶液，0.5 mL β-巰基乙醇，2.5 mL OPA 溶液(50 mg/mL甲醇)混勻，用蒸餾水定容到100 mL。

取凍干的腐乳樣品1.0g于離心管中，加10 mL蒸餾水，均質(zhì)(19 000 r/min)2 min，沸水浴15 min，室溫下150 r/min振蕩1 h，15 800g離心20 min，取上清液，過(guò)0.45μm濾膜，得到樣品水提物，4℃保存?zhèn)溆?。?00 μL樣品水提物加2 mLOPA試劑，混勻，靜置10 min，340 nm測(cè)吸光度。以谷胱甘肽做標(biāo)準(zhǔn)曲線，谷胱甘肽濃度分別為 0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.50，2.00 mg/mL。

1.8 氨基態(tài)氮含量測(cè)定

參見(jiàn) SB/T 10170［13］，稍有改動(dòng)。取 3.000 g腐乳凍干樣品于燒杯中，加入20 mL水，加熱煮沸，冷卻至室溫后，移入100 mL容量瓶中，用水定容至刻度線，混勻，用干燥濾紙過(guò)濾，得到樣品濾液。取10 mL濾液于150 mL燒杯中，加入50 mL水，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，用0.1mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH 8.2，加入10 mL甲醛，繼續(xù)滴定至pH 9.2，記下加入甲醛后氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的體積。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過(guò)單個(gè)生物胺標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC檢測(cè)，得到8種生物胺的保留時(shí)間，色胺為(10.219±0.031)min，β-苯乙胺為(12.133±0.030)min，腐胺為(12.800 ±0.030)min，尸胺為(13.760 ±0.038)min，組胺為(14.680±0.027)min，酪胺為(18.586±0.027)min，亞精胺為(19.411 ±0.026)min，精胺為(24.164±0.061)min?；旌习返腍PLC檢測(cè)結(jié)果可以得出該方法對(duì)8種生物胺的分離效果較好(見(jiàn)圖1)。8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程見(jiàn)表1，R2均大于0.998，說(shuō)明峰面積與生物胺含量之間具有很強(qiáng)的線性相關(guān)性。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)生物胺HPLC檢測(cè)圖譜

表1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及R2

2.2 腐乳前酵過(guò)程中多肽含量的變化

谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.413 2x－0.001 2，且R2=0.999 9，說(shuō)明在0～2.00 mg/mL范圍內(nèi)，吸光度與濃度有良好的線性關(guān)系。在前酵過(guò)程中，多肽含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在36h內(nèi)，雅致放射毛霉發(fā)酵的豆腐多肽含量高于少孢根霉發(fā)酵的，48h后，少孢根霉發(fā)酵豆腐中多肽含量明顯高于雅致放射毛霉發(fā)酵的(圖2)，發(fā)酵到72h，雅致放射毛霉和少孢根霉發(fā)酵的腐乳中多肽含量分別達(dá)到了4.2g/100g、7.2g/100g。

圖2 雅致放射毛霉和少孢根霉發(fā)酵過(guò)程中多肽含量

2.3 腐乳前酵過(guò)程中氨基態(tài)氮含量及生物胺含量變化

豆腐坯中氨基態(tài)氮的含量很低，經(jīng)過(guò)發(fā)酵，雅致放射毛霉和少孢根霉發(fā)酵的腐乳中氨基態(tài)氮的含量均有不同程度的增加，雅致放射毛霉發(fā)酵腐乳中氨基態(tài)氮含量一直高于少孢根霉發(fā)酵的腐乳，發(fā)酵到72h，氨基態(tài)氮含量分別達(dá)到0.50g/100g、0.40g/100g(見(jiàn)圖3)。

圖3 雅致放射毛霉和少孢根霉發(fā)酵過(guò)程中氨基態(tài)氮含量

在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，總胺含量一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且雅致放射毛霉發(fā)酵產(chǎn)生總胺含量一直高于少孢根霉發(fā)酵產(chǎn)生的總胺含量(見(jiàn)圖4)，發(fā)酵到72h時(shí)，總胺含量分別達(dá)到971.1 mg/kg和782.0 mg/kg。Nout［14］等研究了少孢根霉發(fā)酵的天培(tempe)中總胺含量的變化，少孢根霉發(fā)酵的天培中總胺含量大約為1800 mg/kg，主要含有腐胺和酪胺;添加肺炎克雷伯氏菌和白吉利絲孢酵母后，總胺含量略有增加，達(dá)到2 100 mg/kg，尸胺含量增加;添加植物乳桿菌后，酪胺含量降低，總胺含量為 1 000 mg/kg。Tao Tang［15］等對(duì)成品腐乳中總胺含量進(jìn)行檢測(cè)，微生物發(fā)酵腐乳中總胺含量為129.0 mg/kg，酶制腐乳中總胺含量為137.7 mg/kg。相比之下，前酵結(jié)束時(shí)，總胺含量相對(duì)較高。

圖4 雅致放射毛霉和少孢根霉發(fā)酵過(guò)程中總胺含量變化

在雅致放射毛霉發(fā)酵過(guò)程中，色胺、腐胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺含量變化呈現(xiàn)較平緩的趨勢(shì)，均在50 mg/kg以下;β-苯乙胺的含量在發(fā)酵36h內(nèi)呈上升趨勢(shì)，36h以后含量逐漸下降。而尸胺和酪胺含量較高，且在發(fā)酵36h之后含量迅速增加(見(jiàn)圖5)。少孢根霉發(fā)酵36h后，酪胺含量迅速增加，占總胺含量的大部分，其余7種生物胺含量變化不大，且含量均在50 mg/kg以下(見(jiàn)圖6)。

圖5 雅致放射毛霉發(fā)酵過(guò)程中生物胺含量

圖6 少孢根霉發(fā)酵過(guò)程中生物胺含量

在腐乳的前酵過(guò)程中，主要是微生物在白坯上生長(zhǎng)繁殖并分泌酶，使大分子降解成小分子。從以上數(shù)據(jù)可以看出，在前酵過(guò)程中，蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)不同程度的降解生成了相對(duì)較小的多肽和氨基酸，并且多肽和氨基酸的含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加。全明海［16］研究了雅致放射毛霉發(fā)酵腐乳中蛋白酶活力的變化，0～12h蛋白酶活力增長(zhǎng)很慢，12～36h呈線性迅速增加，36～48 h增長(zhǎng)速度有所下降，但仍呈上升趨勢(shì)。這與雅致放射毛霉前酵過(guò)程中多肽含量的變化趨勢(shì)相一致，但多肽含量的增加相對(duì)蛋白酶活有一定的滯后性，多肽含量在24～48 h增長(zhǎng)較快，48 h后仍呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但增速較慢。多肽進(jìn)一步分解為小分子的氨基酸，氨基態(tài)氮含量一直呈上升趨勢(shì)，且雅致放射毛霉發(fā)酵產(chǎn)生的氨基態(tài)氮含量一直高于少孢根霉發(fā)酵的產(chǎn)物，并與生物胺總量的變化趨勢(shì)一致，這與Lu Yongmei［17］等的研究結(jié)果一致。Lu Yongmei等針對(duì)40種不同發(fā)酵方式的醬油中生物胺含量進(jìn)行了檢測(cè)，氨基態(tài)氮含量高的樣品中總胺含量也相應(yīng)較高。Andic［18］等人對(duì) Herby Cheese中的生物胺進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)干酪中含氮物質(zhì)的含量與生物胺的含量之間具有相關(guān)性，水溶性蛋白、三氯乙酸溶解性蛋白和磷鎢酸溶解性蛋白含量高的樣品中，生物胺含量高，水溶性蛋白與苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺的含量呈正相關(guān)。生物胺通常是游離氨基酸脫羧產(chǎn)生的，即氨基酸脫去α-羧基形成的，食品中主要的生物胺色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺分別由其相應(yīng)的前體氨基酸色氨酸、苯丙氨酸、鳥(niǎo)氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸脫羧形成［4］。在腐乳前酵過(guò)程中，通過(guò)微生物的作用，蛋白質(zhì)不斷降解，小分子含氮物質(zhì)多肽和氨基酸含量增加，為生物胺的形成提供了前體物質(zhì)，這從一定程度上解釋了氨基態(tài)氮和生物胺變化趨勢(shì)的一致性。

3 結(jié)論

雅致放射毛霉和少孢根霉在腐乳前酵過(guò)程中，多肽、氨基態(tài)氮及生物胺的含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，生物胺總量的升高與含氮物質(zhì)含量的升高有一定聯(lián)系。代謝產(chǎn)生的生物胺種類有所差別，雅致放射毛霉發(fā)酵腐乳中主要以尸胺和酪胺為主，含量分別達(dá)到460.1、318.5 mg/kg，兩者共占生物胺總量的80.2%，其余六種生物胺含量均低于100 mg/kg。而少孢根霉發(fā)酵腐乳中尸胺含量為668.0 mg/kg，遠(yuǎn)高于其他種類的生物胺，其余7種生物胺含量均低于50 mg/kg。這有可能與微生物自身所含有的脫羧酶種類不同有關(guān)，不同微生物對(duì)氨基酸的利用不同，產(chǎn)生的生物胺種類也會(huì)有區(qū)別。因此，腐乳發(fā)酵過(guò)程中生物胺的產(chǎn)生機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

［1］ Lehane L，Olley J．Histamine fish poisoning revisited［J］．International Journal of Food Microbiology，2000，58(1/2):1－37.

［2］ Caston J C，Eaton C L，Gheorghui B P，et al．Tyramine induced hypertensive episodes，panic attacks in hereditary deficient monoamine oxidase patients:case reports［J］．The Journal of the South Carolina Medical Association，2002，98:187－192.

［3］ Ten Brink B，Damink C，Joosten H M L J，et al．Occurrence and formation of biologically amines in food［J］．International Journal of Food Microbiology，1990，11(1):73－84.

［4］ Santos M H S．Biogenic amines:their importance in foods［J］．International Journal of Food Microbiology，1996，29(2－3):213－231.

［5］ Shalaby A R．Significance of biogenic amines to food safety and human health［J］．Food Research International，1996，29(7):675－690.

［6］ Hernández-Jover T，Izquierdo-Pulido M，Veciana-Nogués M T，et al．Biogenic amine and polyamine contents in meat and meat products［J］．Journal of Agriculture and Food Chemistry，1997，45(6):2 098－2 102.

［7］ Suzzia G，Gardini F．Biogenic amines in dry fermented sausages:a review［J］．International Journal of Food Microbiology，2003，88(1):41 －54.

［8］ Beneduce L，Romano A，Capozzi V，et al．Biogenic amine in wines［J］．Ann Microbiol，2010，60(4):573 －578.

［9］ Mohamed R，Simon-Sarkadi L，Hassan S，et al．Changes in free amino acids and biogenic amines of Egyptian saltedfermented fish(Feseekh)during ripening and storage［J］．Food Chemistry，2009，115(2):635－638.

［10］ Favaro G，Pastore P，Saccani G，et al．Determination of biogenic amines in fresh and processed meat by ion chromatography and integrated pulsed amperometric detection on Au electrode［J］．Food Chemistry，2007，105(4):1 652－1 658.

［11］ 徐振，孟勇，朱志遠(yuǎn)，等．反相高效液相色譜法測(cè)定冷卻豬肉中生物胺［J］．江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，20(8):82－84.

［12］ Church F C，Swaisgood H E，Porter D H，et al．Spectrophotometric assay using o-phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins［J］．Journal of Dairy Science，1983，66(6):1 219－1 227.

［13］ SB/T 10170－2007.腐乳［S］．

［14］ Nout＇M J R，Ruikes M M W，Bouwmeester H M．Effect of processing conditions on the formation of biogenic amines and ethyl carbamate in soybean tempe［J］．Journal of Food Safety，1993，13(4):293－303.

［15］ Tao Tang，Kun Qian，Tianyu Shi，et al．Monitoring the contents of biogenic amines in sufu by HPLC with SPE and pre-column derivatization［J］．Food Control，2011，22(8):1 203－1 208.

［16］ 全明海．以雅致放射毛霉和少根根霉發(fā)酵腐乳的研究［D］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［17］ Lu Yongmei，Chen Xiaohong，Jiang Mei，et al．Biogenic amines in Chinese soy sauce［J］．Food Control，2009，20:593–597.

［18］ Andic S，Genccelep H，Kose S．Determination of biogenic amines in herby cheese［J］．International Journal of Food Properties，2010，13(6):1 300－1 314.