包璐瑩,謝艷英,黃志博,夏秀芳
(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)
酪胺(tyramine,Tyr)又稱4-羥基苯乙胺,分子式為C8H11NO,屬于芳香族生物胺,分子量為137.2,是一種低分子量的單胺[1],具有熱穩(wěn)定性,無法通過熱處理滅活[2]。它廣泛存在于各種食品中,如李子[3]、魚及魚制品[4]和肉及肉制品[5]等。在人體中也存在少量酪胺,因腸道內(nèi)存在可以降解酪胺的單胺氧化酶[6],所以處于低濃度水平的酪胺不會對人體造成危害。但在肉制品尤其是發(fā)酵肉制品的發(fā)酵和成熟過程中或腌制、熏制的魚肉中,由于微生物的作用或貯藏條件不當(dāng),酪胺會逐漸積累至對人體有害的濃度[7]。目前,歐盟沒有明確規(guī)定食品中酪胺的安全閾值,但是美國的食品藥品監(jiān)督局(Food and Drug Administration,FDA)已規(guī)定魚中酪胺含量不得超過100 mg/kg[8],Brink等[9]也建議食品中酪胺的最大濃度不應(yīng)超過800 mg/kg。酪胺與食品衛(wèi)生安全密切相關(guān)。它可作為間接的細(xì)菌指標(biāo)之一[10],與肉制品腐敗相關(guān)的生物胺的濃度加和后用于評估肉質(zhì)的指標(biāo)即生物胺指數(shù)[11](biogenic amines index,BAI),Hernndez-Jover等[12]利用酪胺、組胺、腐胺和尸胺四種生物胺的濃度加和得到該指數(shù),并提出若BAI<5 mg/kg,說明肉質(zhì)新鮮;若BAI在5~20 mg/kg范圍內(nèi),說明肉開始腐敗但仍可接受;若BAI在20~50 mg/kg范圍內(nèi),說明肉質(zhì)低下;若BAI>50 mg/kg,說明肉已經(jīng)腐敗。
鑒于酪胺在食品中存在的廣泛性及其對人體健康的潛在危害,人們相繼開發(fā)了大量的方法對肉制品中的酪胺進行純化、定量和控制。檢測產(chǎn)酪胺菌的傳統(tǒng)微生物法周期長、靈敏度低、操作復(fù)雜[13]。檢測產(chǎn)酪胺菌功能基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),若擴增引物和擴增條件選擇不當(dāng),會導(dǎo)致擴增效果差從而影響準(zhǔn)確性[14]。而且微生物代謝復(fù)雜,在培養(yǎng)過程中容易產(chǎn)生酸性或堿性物質(zhì),造成假陰性或假陽性結(jié)果[13]。與微生物檢測產(chǎn)酪胺菌方法相比,檢測酪胺含量的方法更加準(zhǔn)確和簡單。為保證酪胺不會對人體產(chǎn)生危害,除了對其進行檢測外還需控制其產(chǎn)生和積累??刂迫庵破分杏坞x氨基酸含量會對其風(fēng)味產(chǎn)生影響[15],故人們對于酪胺的控制主要集中在破壞肉制品中酪氨酸脫羧酶和單胺氧化酶的平衡及抑制產(chǎn)酪胺菌的生長。
本文綜述了肉制品中酪胺的檢測方法所需樣品前處理的優(yōu)缺點和各檢測方法的特點及肉制品在加工前、加工時和貯藏時應(yīng)用到的控制技術(shù),為肉制品中酪胺研究提供參考。
酪胺作為一種非揮發(fā)性的低分子量含氮有機物,對人體可以產(chǎn)生不同的生理和毒理作用。人體攝入酪胺后,酪胺主要存在于大腦、胃和腸道中,其生理作用表現(xiàn)在可以作為神經(jīng)遞質(zhì)[16]、使外周血管收縮[17]、增強呼吸作用[18]、使血壓升高[19]等。它可以在人的正常代謝活動中降解,其降解機制如圖1(a)所示,人體中降解酪胺的酶主要是單胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO),包括單胺氧化酶A(monoamine-A,MAO-A)和單胺氧化酶B(monoamine-B,MAO-B)兩種同工酶。MAO-A主要負(fù)責(zé)胃和腸道中酪胺的降解,以阻止全身吸收酪胺;而MAO-B負(fù)責(zé)大腦中酪胺的降解[20-21]。
圖1 人體中酪胺降解機制與毒性
圖2 胃腔中C-亞硝化酪胺形成機制及毒性
因樣品基質(zhì)復(fù)雜且酪胺屬痕量物質(zhì),故為了獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果,要對樣品進行預(yù)處理。一是酪胺的提取,使半固體的肉樣轉(zhuǎn)化為液體以便進一步分析。二是酪胺的富集與凈化,以從上述提取液中去除干擾物并濃縮酪胺,操作步驟如圖3所示。
圖3 固相萃取、液-液萃取和頂空固相微萃取步驟
肉及肉制品常用酸性溶劑三氯乙酸或高氯酸提取酪胺[27],但在液相色譜-質(zhì)譜法檢測酪胺時,這些氯化萃取劑很容易停留在離子通道內(nèi),在負(fù)離子檢測模式下造成離子抑制,利用5-磺基水楊酸作為提取劑可解決這一問題[28]。傳統(tǒng)的富集與凈化方法包括固相萃取(solid phase extraction,SPE)和液-液萃取(liquid-liquid phase extraction,LLE),但由于它們耗時、萃取效率低、試劑消耗量大且成本高,現(xiàn)已發(fā)展出了頂空固相微萃取(head space solid phase microextraction,HS-SPME)和分散液-液微萃取(dispersive liquid-liquid phase microextraction,DLLME),它們分別是固相萃取和液-液萃取的小型化模式,僅需少量的固體吸附劑和化學(xué)試劑就能實現(xiàn)樣品中酪胺的富集與凈化,而液相微萃取因其具有分析物從水相到萃取相的轉(zhuǎn)移速度快、萃取效率高且穩(wěn)定和成本低的優(yōu)點,應(yīng)用較固相微萃取更廣泛[29]。
其中DLLME通過加入分散劑可實現(xiàn)酪胺在水相與萃取相之間的快速轉(zhuǎn)移[30],也可以利用超聲輔助萃取使樣品提取液與萃取相充分接觸并分散在水相中以提高酪胺的萃取效率[31],且DLLME能增加酪胺的揮發(fā)性,有利于使用氣相色譜法檢測酪胺[32],但DLLME中常用的萃取試劑鹵代烴有毒,不環(huán)保,現(xiàn)已有采用磁性離子液體如3-己基-14-烷基膦(Ⅱ)作為萃取試劑的方法[33]。各富集與凈化方法及其優(yōu)缺點見表1。
表1 酪胺的富集與凈化方法及優(yōu)缺點比較
在聯(lián)用檢測方法中,樣品經(jīng)預(yù)處理后即可進行酪胺與樣品基質(zhì)中其它物質(zhì)的分離。由于色譜儀器具有良好的分離與檢測能力,常用于酪胺的定性檢測,包括液相色譜法[39]、氣相色譜法[32]和毛細(xì)管電色譜法[40]。而高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)由于其具有選擇性好、靈敏度高、通用性強的優(yōu)點,現(xiàn)已成為最普遍的酪胺色譜分離方法。
為了提高酪胺檢測的準(zhǔn)確性并考慮到待測樣品的特點,這些分離方法還需進一步與不同的檢測器如熒光檢測器(fluorescence detector,FL)、紫外檢測器(ultraviolet detector,UV)、質(zhì)譜儀和激光誘導(dǎo)檢測器(laser induced fluorescence,LIF)聯(lián)用。因酪胺不具有熒光發(fā)色基團和紫外吸收基團且極性大,故在進行熒光檢測和紫外檢測前,常用丹磺酰氯[5](dansyl chloride)、苯甲酰氯[4](benzoyl chloride)和達(dá)比氯[41](dabsyl chloride)對樣品進行衍生化處理,使酪胺的氨基與衍生試劑發(fā)生反應(yīng)轉(zhuǎn)化為帶有發(fā)色和吸收基團的衍生產(chǎn)物,這些常用衍生試劑與酪胺發(fā)生的衍生反應(yīng)如圖4所示[42-44]。衍生化處理在質(zhì)譜檢測中不是必需步驟,但進行衍生化處理,能夠增強酪胺的保留,提高電離效率和靈敏度。He[45]合成了一種新型且靈敏的衍生試劑4-羰基氯玫瑰胺,可作為質(zhì)譜檢測中的衍生化試劑。
2.2.1 與紫外檢測器聯(lián)用的檢測方法 若預(yù)處理后樣品中雜質(zhì)的紫外吸收值低,常與紫外檢測器聯(lián)用進行檢測。紫外檢測器原理是基于Lambert-Beer定律,通過衍生后酪胺的紫外吸收強度計算其濃度。Cao等[33]選用紫外吸收值低的磁性液體3-己基-14-烷基膦(Ⅱ)作為DLLME的萃取劑,對魚樣中酪胺進行萃取和預(yù)濃縮后,結(jié)合HPLC-UV法對酪胺含量進行測定,LOD為1.6 μg/kg,回收率在94.8%~97.9%范圍內(nèi)。此類檢測方法需衍生化但預(yù)處理操作簡單,靈敏度高。
2.2.2 與熒光檢測器聯(lián)用的檢測方法 熒光檢測器的工作原理是用紫外線照射化合物時,化合物可受激發(fā)而發(fā)出熒光,測定發(fā)出的熒光能量即可對此化合物定量。因此,決定熒光檢測器靈敏度的一個重要因素就是熒光激發(fā)波長和發(fā)射波長的選擇,對于不同的目標(biāo)分析物要選擇不同的激發(fā)波長及發(fā)射波長。Donthuan等[46]設(shè)定熒光激發(fā)波長為270 nm,發(fā)射波長為315 nm,對9-芴甲基氯甲酸酯衍生后經(jīng)超聲輔助分散液-液微萃取處理的酪胺含量進行測定,LOD為0.02 ng/mL。Li等[47]設(shè)定熒光激發(fā)波長為270 nm,發(fā)射波長為430 nm,采用HPLC-FL法對乙基吖啶磺酰氯熒光標(biāo)記的酪胺含量進行測定,LOD為0.38 ng/mL,無需富集與凈化即可準(zhǔn)確測定酪胺含量。
圖4 常用衍生劑與酪胺的衍生反應(yīng)
2.2.3 與質(zhì)譜儀聯(lián)用的檢測方法 液相色譜[35]和氣相色譜[32]常與質(zhì)譜儀聯(lián)用檢測酪胺。Ochi等[35]用離子對固相萃取法萃取腌鯖魚片中的酪胺后,采用超高效液相色譜法與三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用對酪胺含量進行測定,LOD為0.02 mg/kg,回收率在90.6%~91.9%范圍內(nèi)。Wojnowski等[32]選用甲醇作為DLLME的分散試劑對肉樣進行富集與凈化處理,增加了酪胺的揮發(fā)性,便于采用氣相色譜-質(zhì)譜法進行酪胺測定,LOD為0.007 mg/kg,回收率為87%。色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測無需衍生化,預(yù)處理簡單,取代了許多復(fù)雜耗時的檢測方法,具有快速、準(zhǔn)確度和靈敏度高的優(yōu)點。
2.2.4 與激光誘導(dǎo)檢測器聯(lián)用的檢測方法 毛細(xì)管電色譜法(capillary electrochromatography,CEC)是集毛細(xì)管電泳分離的高效率和液相色譜分離的強選擇性為一體的微型分離方法[48],常與激光誘導(dǎo)檢測器聯(lián)用。張冰宇等[49]建立了柱前衍生毛細(xì)管電色譜與激光誘導(dǎo)檢測器聯(lián)用法,成功應(yīng)用于雞肉腸中酪胺含量的測定,該方法LOD為0.4 μg/L。此方法具有化學(xué)試劑用量少,成本相對低,分析用時短的優(yōu)點,但與傳統(tǒng)分離方法相比,其缺點為靈敏度較低,毛細(xì)管填充柱損耗快且不夠穩(wěn)定。
2.3.1 電化學(xué)生物傳感器 電化學(xué)生物傳感器是通過測量生物傳感器表面酶法所生成物質(zhì)的化學(xué)還原相關(guān)的安培信號的衰減,從而計算出樣品中酪胺濃度[50],無需進行富集、凈化及衍生化處理,操作簡便。Apetrei等[50]開發(fā)了一種電流型酪氨酸氧化酶生物傳感器,LOD為0.62 μmol/L,并成功用于腌制和熏制魚制品中酪胺含量的檢測。屠青霞[51]制備了固相電化學(xué)發(fā)光傳感器用于酪胺的檢測,得到LOD為0.064 μmol/L,并成功用于四種魚中酪胺含量的檢測。與傳統(tǒng)檢測方法相比,電化學(xué)生物傳感器為酪胺的實時在線分析提供了簡單、快速且經(jīng)濟的檢測方法,但缺點為無法排除基質(zhì)中其它化合物的干擾。
2.3.2 方波伏安法 方波伏安法是利用同時向工作電極疊加特定的電信號及電壓后產(chǎn)生的振幅曲線,通過在一個周期時間內(nèi)對電流兩次取樣從而測定待測物質(zhì)的電化學(xué)分析方法[52]。Henao-Escobar等[53]選用摻硼金剛石電極作為工作電極,用6種不同的有機試劑對火腿中的酪胺進行提取,采用方波伏安法對有機提取液中的酪胺含量進行測定,并將此方法檢測結(jié)果的平均值與傳統(tǒng)的HPLC法測定結(jié)果的平均值進行t檢驗,發(fā)現(xiàn)兩種方法測得酪胺含量的均值相差不大,說明伏安法可準(zhǔn)確地測定火腿中酪胺含量。此方法準(zhǔn)確度高,樣品前處理簡單,摻硼金剛石電極具有環(huán)保、導(dǎo)電性好、電化學(xué)窗口寬、背景電流低、物理和化學(xué)穩(wěn)定性高且抗腐蝕的優(yōu)點,伏安法可考慮作為酪胺傳統(tǒng)檢測方法的替代方法。
2.3.3 離子遷移率譜法 離子遷移率譜法(ion mobility spectrometry,IMS)是一種在均勻電場的作用下,根據(jù)氣態(tài)分析物離子通過氣體氛圍的遷移率不同從而將其分離的分析方法[54]。Parchami等[37]采用離子遷移率譜法對罐裝魚制品中酪胺含量進行測定,通過使用18-冠醚-6作為氣相修飾劑以解決離子遷移率譜出現(xiàn)重疊峰的問題,發(fā)現(xiàn)生物胺相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.7%~6.3%,且測定結(jié)果與GC-MS法測定結(jié)果相差不多。該方法靈敏度高,無需衍生化處理,操作簡便。
2.3.4 分子印跡聚合物 將分子印跡聚合物用作SPE法的吸附劑,可實現(xiàn)對目標(biāo)分析物高度專一地識別[55]。Zhang等[36]通過將共價有機骨架接枝到量子點上合成了一種分子印跡聚合物,該量子點的部分氨基可與酪胺非共價結(jié)合,將此分子印跡聚合物作為吸附劑,利用該吸附劑與酪胺結(jié)合會發(fā)生熒光猝滅的特性,采用光感法對肉末樣品中的酪胺進行測定,LOD為7.0 μg/kg,此方法成功地應(yīng)用于豬肉和雞肉香腸、豬肉和雞肉火腿、培根、熏豬肉和意大利發(fā)酵香腸中酪胺含量的測定,測定結(jié)果與SPE-HPLC法測定得到的結(jié)果相近。分子印跡聚合物具有構(gòu)效可預(yù)測、對目標(biāo)分析物可高度專一性識別、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定及普適的優(yōu)點,但缺點為傳質(zhì)速度慢且不夠穩(wěn)定。
肉制品中產(chǎn)酪胺菌產(chǎn)生酪氨酸脫羧酶(tyrosine decarboxylase,TDC),在酶的作用下游離酪氨酸發(fā)生脫羧反應(yīng)生成酪胺[56],或在酸性條件下游離酪氨酸與脂質(zhì)氧化產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)生成酪胺[57]。酪胺檢測完成后,為保證酪胺含量不會達(dá)到對人體產(chǎn)生危害的閾值,需根據(jù)肉制品所處階段及兩種酪胺形成途徑,對肉制品中的酪胺含量進行控制。
3.2.1 涂層的選擇 選擇涂層的原則是盡量抑制原料肉中微生物的生長,復(fù)合涂層比單一涂層的控制效果好。如將表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)與明膠生物膜交聯(lián)后使膜更加堅硬致密,且具有更高的抗菌性[58]。Cao等[59]將EGCG的優(yōu)良抗菌特性與明膠可保護魚的微結(jié)構(gòu)、維持其肌纖維的穩(wěn)定性從而顯著降低其變質(zhì)幾率的特性相結(jié)合,研究發(fā)現(xiàn)分別用明膠、EGCG和EGCG-明膠處理液處理后的魚片,在4 ℃下真空包裝貯存21 d過程中,每三天測定魚片中酪胺含量,經(jīng)EGCG-明膠處理液處理的魚片中酪胺含量最低。Zhao等[60]采用魚膠和葡萄籽提取物復(fù)合涂層處理羅非魚魚片,既解決了魚膠抗菌性不足的缺點,又控制了酪胺含量的增加速率。
3.2.2 添加劑的使用 為控制原料肉中酪胺含量,可使用不同的添加劑,包括防腐劑如根皮素[61]和氨乙基根皮素[62],保鮮劑如水基殼聚糖[63]和茶多酚-殼聚糖復(fù)合液[64],抑菌劑如紅花提取物和苦瓜提取物[65]。根皮素能通過抑制產(chǎn)酪胺菌的生長從而延緩貯藏過程中酪胺的形成,但水溶性差是這些天然活性成分在實際應(yīng)用中的主要缺陷,為解決這一問題,Wei等[62]利用2-溴乙胺和根皮素合成了氨乙基根皮素,該物質(zhì)不僅溶解度高,且能顯著控制貯藏過程中酪胺的積累。水基殼聚糖有低聚殼聚糖和納米晶須殼聚糖兩種主要形態(tài),均能抑制腸桿菌屬活性從而抑制酪胺的積累[63]。在茶多酚和殼聚糖分別為3和10 g/L的最佳配比下,該復(fù)合液對鮸魚中的酪胺在4和25 ℃貯藏過程中的積累,具有明顯的抑制效果[64]。紅花提取物和苦瓜提取物均能有效抑制魚中產(chǎn)酪胺菌不動桿菌的產(chǎn)酪胺能力[65]。
3.3.1 不產(chǎn)酪氨酸脫羧酶/具有單胺氧化酶活性的菌株 肉制品中酪氨酸脫羧酶與單胺氧化酶的動態(tài)平衡決定著酪胺含量[66],故選擇發(fā)酵劑的原則為減少酪氨酸脫羧酶含量或增加單胺氧化酶含量。在發(fā)酵肉制品的發(fā)酵過程中,低pH、低溫和高鹽環(huán)境有利于抑制病原菌生長且有利于風(fēng)味產(chǎn)生,將在此條件下正常生長且無TDC活性的菌株作為發(fā)酵劑,可有效減少酪胺生成。如木糖菌株Sx-3和Sx-8對低pH、低溫和高鹽表現(xiàn)出了高抗性,且均無TDC活性,可作為發(fā)酵魚制品的發(fā)酵劑[67]。另一方面,單胺氧化酶可將肉制品中已生成的酪胺降解為醛類、過氧化氫和氨[68],將具有單胺氧化酶活性的菌株用作不同肉制品的發(fā)酵劑可有效減少酪胺積累。翟鈺佳[66]從傳統(tǒng)發(fā)酵的肉腸中分離篩選出具有單胺氧化酶活性的植物乳桿菌X22-2,用作羊肉發(fā)酵香腸的發(fā)酵劑可顯著抑制酪胺積累。
3.3.2 抑制產(chǎn)酪胺菌活性的菌株 除破壞發(fā)酵肉制品中TDC與單胺氧化酶之間的平衡外,還可選擇抑制產(chǎn)酪胺菌活性的菌株作為發(fā)酵劑以控制酪胺含量,其原因是這類菌株在發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物如有機酸、過氧化氫和細(xì)菌素能降低體系pH,抑制產(chǎn)酪胺菌的生長[69]。乳酸菌CECT5764、金黃色葡萄球菌SA25和嗜酸乳桿菌CECT903組成的混合發(fā)酵劑可降低達(dá)契亞香腸中酪胺含量,與未加入發(fā)酵劑的成品相比,酪胺含量降低了50%以上[70]。乳酸乳球菌KTH0-1S可產(chǎn)細(xì)菌素,與糞腸球菌D0KS13競爭營養(yǎng)物質(zhì)從而抑制其生長,可作為泰國發(fā)酵蝦宮尾蝦的發(fā)酵劑,與未使用該發(fā)酵劑的成品相比,酪胺積累量減少了31%[71]。
對不同肉制品來說,添加劑的種類和用量對其酪胺含量的控制效果不同。葡萄酒能增加干發(fā)酵香腸的香氣并抑制酪胺的積累,當(dāng)其在意大利臘腸中添加量為7.5%時,發(fā)酵60 d后,酪胺最終積累量減少了3.53 mg/kg[72]。綠茶多酚(Green tea polyphenols,GTP)是肉制品中常用的天然抗氧化劑,添加GTP的干腌培根經(jīng)過12 d成熟后,酪胺含量比未添加GTP的干腌培根減少了50.6%[73]。此外,發(fā)酵劑與植物提取物如生姜精油的協(xié)同作用也能有效抑制酪胺積累[74]。
貯藏過程中酪胺的產(chǎn)生與脂質(zhì)氧化和貯藏條件密切相關(guān)。脂質(zhì)氧化物的存在會使酪氨酸發(fā)生脫羧反應(yīng)生成酪胺[57],因此常采用聚乙烯薄膜、玻璃罐或金屬罐使肉制品處于真空狀態(tài)的方法減少脂質(zhì)氧化。貯藏條件如溫度、pH等會影響產(chǎn)酪胺菌的生長從而影響酪胺含量。雷志方等[75]研究發(fā)現(xiàn)溫度越低酪胺生成速率越慢。一種由碳酸鈣、滑石和二氧化鈦結(jié)合而成,并在表面涂上高密度聚乙烯樹脂的新型材料OVTENE@可實現(xiàn)對pH的控制,從而控制酪胺含量,使用這種材料在真空條件下貯藏的意大利臘腸,15個月后臘腸中酪胺含量比同等條件下使用玻璃罐貯藏相同時間的意大利臘腸的酪胺含量減少了60%[76],且該材料的合成無需水、樹木和膠料,100%可循環(huán)再造,可分解或生物降解[77],是一種能有效控制貯藏期間肉制品中酪胺含量的環(huán)保包裝材料。
酪胺的常規(guī)檢測方法主要集中在HPLC/RP-HPLC與不同的檢測器聯(lián)用,但此方法前處理復(fù)雜,與紫外檢測器和熒光檢測器聯(lián)用檢測時還需進行衍生化,耗時且成本高。新型檢測技術(shù)雖然具有前處理簡單甚至無需進行前處理、準(zhǔn)確度和選擇性高的優(yōu)點,但研究還不成熟,因此無法廣泛應(yīng)用。如何建立操作簡單、環(huán)保、準(zhǔn)確度高且成本低的酪胺檢測方法是未來需要解決的問題。
肉及肉制品中的酪胺因其濃度不同而對人體產(chǎn)生影響不同的特殊性,對其進行檢測和控制就會成為消費者最關(guān)注的問題。加工前對原料肉中酪胺的控制技術(shù)以物理技術(shù)如涂層和化學(xué)技術(shù)如使用添加劑為主,加工時對酪胺的控制技術(shù)以生物技術(shù)如使用無TDC活性的菌株做發(fā)酵劑為主,貯藏時對肉制品中酪胺的控制技術(shù)以物理技術(shù)為主。但酪胺的產(chǎn)生與積累是一個受到多種因素及其相互作用影響的復(fù)雜的過程,因素組合的多樣性和易變性及肉制品種類不同也會影響酪胺的生成和積累程度,因此根據(jù)實際情況采用有效的復(fù)合防控技術(shù)對原料肉及肉制品中的酪胺進行控制是未來的研究方向。