卜貴軍

(1.湖北省生物資源保護(hù)與利用重點實驗室(湖北民族學(xué)院)，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

草甘膦是內(nèi)吸的，無選擇性的除草劑.草甘膦可以通過抑制莽草酸途徑，來抑制芳香族氨基酸的合成，從而除掉雜草.但由于它是非選擇性的，在除掉雜草的同時，如果遇到綠色作物，也會對其造成傷害.隨著生物技術(shù)的發(fā)展，一批抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物[1-2]的出現(xiàn)，使問題得到解決.而轉(zhuǎn)基因大豆中主要是抗除草劑草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆[3-7]，到2007年已占到全球大豆的64%[8].

抗草甘膦大豆通過轉(zhuǎn)入CP4-EPSPS，使得大都對草甘膦不敏感，這樣芳香族氨基酸能夠繼續(xù)合成，大豆生長發(fā)育能正常進(jìn)行.

種植抗草甘膦大豆就需要配套的使用大量的草甘膦以除去雜草.草甘膦市場越來越大.重新認(rèn)識草甘膦對抗草甘膦植物和普通植物的傷害就變得非常必要.

Delannay X等[9]的研究表明，對抗草甘膦大豆噴施草甘膦對株型的快速生長無影響，不會導(dǎo)致顯著的傷害.Elmore R W，Nelson K A等的研究表明[10-11]，按照說明書使用對抗草甘膦大豆施用草甘膦，不會影響生長和產(chǎn)量.Kelly A等[12]的研究表明，草甘膦對抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的葉面積指數(shù)、生殖生長、營養(yǎng)生長以及產(chǎn)量都不會有明顯影響.然而，這些研究都停留在宏觀水平，噴施草甘膦后，關(guān)于抗草甘膦大豆的葉片表皮細(xì)胞的變化，開口氣孔個數(shù)變化及氣孔結(jié)構(gòu)的變化的研究，國內(nèi)外還未見有報道.

本研究以抗草甘膦大豆和東農(nóng)42為材料，噴施草甘膦，利用掃描電鏡來研究草甘膦對東農(nóng)42和抗草甘膦大豆的不同作用.本研究引入了草甘膦對植物的超微結(jié)構(gòu)影響的研究，為草甘膦的作用機理研究拓展新的視野.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

東農(nóng)42(Glycinemax(L.) Merr. Dongnong 42)由東農(nóng)大豆研究所提供.轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2(Glycinemax(L.) Merr.GTS 40-3-2)由東農(nóng)轉(zhuǎn)基因作物檢測中心提供.草甘膦為41%的草甘膦異丙銨鹽.

1.2 田間噴藥

大豆種植，采用小區(qū)對比相鄰種植設(shè)計.行距62 cm，株距12 cm，行長50 m.大豆處于營養(yǎng)生長，第3到第5復(fù)葉期，即V3～V5期，噴施草甘膦.分別在第1次噴藥前(0 d)和噴藥后的第1、2、3、4、5、6、7 d，14 d，21 d，28 d，42 d取樣.設(shè)4個處理：東農(nóng)42不噴藥、東農(nóng)42噴藥、GTS 40-3-2不噴藥、GTS 40-3-2噴藥.根據(jù)說明書按1∶100噴施草甘膦.

1.3 取樣

取下葉片，置于冰盒中，帶回實驗室.葉片取材說明：取3次，每次都取第3片三重復(fù)葉的中間一片得第2葉脈與第3葉脈中間部位.

1.4 掃描電鏡觀察

掃描電鏡處理過程包括：取材、固定、沖洗、脫水、置換、用ES-2030(HITACHI)型冷凍干燥儀對樣品進(jìn)行干燥、粘樣、在E-1010(HITACHI)型離子濺射鍍膜儀鍍膜、將處理好的樣品放在的S-3400掃描電鏡(日立公司)下觀察.

2 結(jié)果與分析

2.1 東農(nóng)42噴施草甘膦后葉片的掃描電鏡觀察

噴施草甘膦后東農(nóng)42的葉片上表皮的變化如圖1所示.

在噴藥后第4天時，東農(nóng)42的上表皮細(xì)胞出現(xiàn)變形(圖1-17).在噴藥后第6天和第7天時，上表皮細(xì)胞變形嚴(yán)重，并下陷明顯(圖1-25，29).在噴藥后第1天時，上表皮細(xì)胞的氣孔，有部分氣孔變形(圖1-6)，到噴藥后第4天時氣孔器的內(nèi)壁明顯出現(xiàn)皺縮的跡象(圖1-18)，這種皺縮隨噴藥天數(shù)的增加，其變形程度加大(圖1-22，26，30).

圖1 噴施草甘膦后上表皮細(xì)胞的掃描電鏡觀察圖1-1 未噴施草甘膦的東農(nóng)42的葉片的上表皮，圖1-2 未噴施草甘膦的東農(nóng)42的葉片的上表皮的氣孔，圖1-3 未噴施草甘膦的抗草甘膦大豆的葉片的上表皮，圖1-4 未噴施草甘膦的抗草甘膦大豆的葉片的上表皮的氣孔圖1-5，9，13，17，21，25，29 噴施草甘膦1～7 d后東農(nóng)42的葉片的上表皮的變化，圖1-6，10，14，18，22，26，30 噴施草甘膦1～7 d后東農(nóng)42的葉片的上表皮氣孔的變化.圖1-7，11，15，19，23，27，31 噴施草甘膦1～7 d后抗草甘膦大豆的葉片的上表皮的變化，圖1-8，12，16，20，24，28，32 噴施草甘膦1～7 d后抗草甘膦大豆的葉片的上表皮氣孔的變化.Fig.1 Epidermal cell change after spraying glyphosate under scanning electron microscopyFig.1-1 Dongnong 42 leaves upper epidermis with no spraying，F(xiàn)ig.1-2 Dongnong 42 leaves stomata with no spraying，F(xiàn)ig.1-3 Glyphosate resistant soybean upper epidermis with no spraying，F(xiàn)ig.1-4 Glyphosate resistant soybean leaves stomata with no spraying，F(xiàn)ig. 1-5，9，13，17，21，25，29 Dongnong 42 leaves upper epidermis change at 1～7 days after spraying， Fig. 1-6，10，14，18，22，26，30 Dongnong 42 leaves stomata change at 1～7 days after spraying，F(xiàn)ig. 1-7，11，15，19，23，27，31 Glyphosate resistant soybean leaves upper epidermis change at 1～7 days after spraying，F(xiàn)ig. 1-8，12，16，20，24，28，32 Glyphosate resistant soybean leaves stomata change at 1～7 days after spraying.

2.2 噴施草甘膦后的抗草甘膦大豆葉片的掃描電鏡觀察

圖1、圖2顯示了抗草甘膦大豆葉片的上表皮在噴施草甘膦后的變化.

圖2 噴施草甘膦后14，21，28，42 d抗草甘膦大豆葉片的上表皮的掃描電鏡觀察圖2-1，3，5，7 噴施草甘膦14，21，28，42 d后抗草甘膦大豆的葉片的上表皮的變化，圖2-2，4，6，8 噴施草甘膦14，21，28，42 d后抗草甘膦大豆的葉片的上表皮的氣孔的變化.Fig.2 Glyphosate resistant soybean leaves epidermal change after spraying 14，21，28，42 days under scanning electron microscopy Fig.2-1，3，5，7 Glyphosate resistant soybean upper epidermis change at 14，21，28，42 days after spraying，F(xiàn)ig.2-2，4，6，8 Glyphosate resistant soybean leaves stomata change at 14，21，28，42 days after spraying.

在噴藥后的42 d內(nèi)，抗草甘膦大豆葉片的上表皮細(xì)胞變化不明顯(圖1，圖2).

抗草甘膦大豆的上表皮的氣孔則有一定程度變化，在噴藥后的第1天到第4天出現(xiàn)了氣孔器內(nèi)壁的明顯變形(圖1-8，12，16，20)，但到第5天及以后(圖1-24)就未發(fā)現(xiàn)如此明顯的變形(圖1，圖2).

2.3 掃描電鏡下開口氣孔個數(shù)的變化

從圖1可以看出，東農(nóng)42葉片在噴藥后1 d急劇下降，到第2天有所恢復(fù)，但此后又進(jìn)一步減少.抗草甘膦大豆的上表皮的氣孔開口數(shù)在噴藥后第1、2天有所下降，但到第3天有所恢復(fù)，到第4、5天又減少，到第6天后逐漸恢復(fù)，接近對照.

圖3 噴藥后上表皮氣孔開口數(shù)的變化Fig.3 Change of the number of epicuticle opening stomata after spraying

3 討論

內(nèi)吸性是草甘膦的特點之一，在噴施后，草甘膦將經(jīng)植物表皮和氣孔進(jìn)入植物體內(nèi)[13]，進(jìn)而影響植物的代謝.而表皮細(xì)胞作為草甘膦進(jìn)入植物體的必經(jīng)途徑，非常容易受到草甘膦的作用，同時植物的表皮細(xì)胞還與植物代謝息息相關(guān).因此，研究草甘膦對大豆葉片表皮細(xì)胞的變化的研究是非常必要的.

在掃描電子顯微鏡下，可以觀察到大豆葉片的表皮細(xì)胞、氣孔的變化.草甘膦對東農(nóng)42的表皮細(xì)胞及氣孔的作用是毀滅性的，但對GTS 40-3-2的表皮細(xì)胞及氣孔作用中表現(xiàn)出的變化，是一個先發(fā)生變化而后逐漸恢復(fù)的過程.這與草甘膦對大豆葉肉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)及生化指標(biāo)的影響相一致[14].東農(nóng)42的表皮細(xì)胞及氣孔在施草甘膦后的前期的變化，非?？赡苁遣莞熟⒓捌漭o劑的物理作用所致，而后來的變化，則是由于草甘膦抑制莽草酸途徑，影響芳香族氨基酸的合成所致.而抗草甘膦大豆GTS 40-3-2的表皮細(xì)胞及氣孔的變化，其原因則比較復(fù)雜，包括：草甘膦作為一種物理過程對細(xì)胞的損害，例如對氣孔導(dǎo)度，葉面溫度，滲透壓等的影響；對本身敏感EPSPS的短時間抑制；草甘膦對葉綠素合成的抑制等.大豆表皮細(xì)胞及氣孔，隨著草甘膦被吸收以及葉片的自身發(fā)育等因素的變化，其影響就逐漸消失.

雖然抗草甘膦大豆的葉片表皮細(xì)胞經(jīng)過一定時間會恢復(fù)，但最終結(jié)果表現(xiàn)為大豆成熟期的短暫延遲，如果大豆經(jīng)歷了這個時期仍可成熟，就像Nelson K A等[11]的研究，不會影響生長和產(chǎn)量，否則，在引入或培育抗草甘膦大豆時，就必須考慮到原始大豆品種的成熟期，而且還必須考慮到噴施草甘膦對它的影響.

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