蘇敬澤，林 謙，農(nóng)一兵

(1.北京市宣武區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，北京 100050;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078)

循環(huán)血中和/或心肌局部血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是引起心肌細(xì)胞肥大的最重要活性物質(zhì)[1～3]，而能量代謝障礙是心肌肥厚和充血性心力衰竭重要的推動(dòng)因素之一，貫穿在心肌肥厚發(fā)生、發(fā)展的全過(guò)程中，是導(dǎo)致心肌肥厚發(fā)展為心衰的重要因素[4]。既往研究表明，黃芪對(duì)心衰、缺血缺氧、再灌注損傷和病毒損傷的心肌，具有保護(hù)心肌線粒體結(jié)構(gòu)、提高生物氧化相關(guān)的多種酶的活性、減少乳酸脫氫酶外漏等作用，從而改善心肌能量代謝[5～7]。我們?cè)谘芫o張素Ⅱ致乳鼠心肌細(xì)胞肥大模型基礎(chǔ)上，選用黃芪注射液(主要成分為黃芪皂苷)和注射用黃芪多糖，觀察其對(duì)心肌細(xì)胞ATP含量的影響，旨在探討黃芪組分對(duì)心肌細(xì)胞能量代謝的干預(yù)作用，為中藥防治心衰提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物與主要試劑

Wistar大鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)，Sigma Inc;絡(luò)沙坦(losartan)，Merck Research Laboratories;黃芪注射液，成都地奧九泓制藥廠，10ml/支(批號(hào)0410027);注射用黃芪多糖，美國(guó)泛華醫(yī)藥公司，250mg/支(批號(hào)8k01101);Trypsin，SigmaInc;CollagenaseⅡ，GibcoInc;Dulbecco’sModified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham，Sigma Inc;胎牛血清(特級(jí))，杭州四季青生物工程材料有限公司;5-Bromo-2’-Deoxyuridind(Brd-u)，Sigma Inc;小鼠α－橫紋肌動(dòng)蛋白單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司;RNAgents Total RNA Isolation system，Promega;Access Quick RT-PCR System，Promega。

1.2 儀器

P4000高效液相色譜儀，UV6000二級(jí)管陣列檢測(cè)器，ChromQuest分析軟件，美國(guó)TSP公司Olympus IX71+制冷攝像頭倒置熒光顯微鏡;SHEL-LAB 2323 CO2培養(yǎng)箱;再鑫CLASS 100超凈臺(tái)。

2 方法

2.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

利用乳大鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞的方法最早由Harary報(bào)道[8]，本實(shí)驗(yàn)以Harary的方法為基礎(chǔ)，同時(shí)參考其他研究者的經(jīng)驗(yàn)，將出生1d～3d的Wistar大鼠(雌雄不拘)在無(wú)菌條件下取出心臟，將心臟剪成1mm3大小的組織塊，胰酶、膠原酶混合消化液，于37℃水浴振蕩分次消化，直至組織塊完全消化。收集除第1次以外的細(xì)胞懸液，加入胎牛血清終止酶消化。4℃離心棄上清，制成單細(xì)胞懸液。然后按差速貼壁分離法孵育1h～1.5h，純化心肌細(xì)胞并計(jì)數(shù)，依需要密度接種。其中細(xì)胞培養(yǎng)液中含有10%胎牛血清、0.1mmol/L的Brd-u及青霉素100 mg/L、鏈霉素100萬(wàn)U/L。細(xì)胞于37℃、5%CO2、95%濕度環(huán)境培養(yǎng)，大約每36h～48h換1次液，培養(yǎng)3d～4d后使用。

細(xì)胞培養(yǎng)第3天用免疫組織化學(xué)方法鑒定心肌細(xì)胞，一抗為小鼠α-橫紋肌動(dòng)蛋白單克隆抗體，DAB顯色，本抗體對(duì)α骨骼肌和α心肌的肌動(dòng)蛋白具有特異性。

2.2 分組與給藥

正常培養(yǎng)3d后換1%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，其他條件不變，實(shí)驗(yàn)共分6組:(1)正常對(duì)照組:不加任何藥物;(2)肥大模型組:10－7mol/L的血管緊張素Ⅱ;(3)絡(luò)沙坦組:10－7mol/L血管緊張素Ⅱ+10－6mol/L losartan;(4)黃芪皂苷組:10－7mol/L血管緊張素Ⅱ+10－2g/L黃芪注射液;(5)黃芪多糖組:10－7mol/L血管緊張素Ⅱ+10－2g/L黃芪多糖注射液;(6)黃芪皂苷合多糖組:10－7mol/L血管緊張素Ⅱ+10－2g/L黃芪注射液+10－2g/L黃芪多糖注射液.

黃芪注射液及黃芪多糖注射液濃度選擇根據(jù)既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果[9]，溶劑為DMEM/F12，工作液濃度為終濃度的100倍。

2.3 ATP含量測(cè)定(HPLC)

參照Enrique CHACON[10]及黨永明[11]的方法并適當(dāng)改進(jìn)。以25cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)心肌細(xì)胞，每瓶細(xì)胞數(shù)約3×106個(gè)，正常培養(yǎng)3d～4d后分組實(shí)驗(yàn)。按24 h、48 h 2個(gè)時(shí)點(diǎn)加藥，每組每個(gè)時(shí)點(diǎn)重復(fù)做3瓶，求其平均值。

2.3.1 樣品制備 冰冷的D-Hanks沖洗細(xì)胞2次，棄去平衡液，稱(chēng)培養(yǎng)瓶重量;每瓶加入1ml10%冰冷的高氯酸，將細(xì)胞刮入EP管中，立即置于液氮中保存，再次稱(chēng)培養(yǎng)瓶重量，計(jì)算重量差值;測(cè)定時(shí)取出，用超聲波細(xì)胞破碎儀將細(xì)胞膜打碎;4℃10000rpm離心30min，取上清液;加入與2.5mol/L KOH，調(diào)PH至6.5，再次4℃10000rpm離心30min;取上清液用0.22μm濾膜過(guò)濾即成測(cè)定樣品。

2.3.2 色譜條件 色譜柱:ODS HYPERSIL C18分析柱(5μm，250mm×4.6mm);柱溫:室溫25℃;流動(dòng)相:50mmol/L磷酸鉀緩沖液(含0.2%甲醇，pH 6.5)。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用微孔濾膜(0.2μm)抽濾、超聲脫氣，流速1 ml/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm;樣品進(jìn)樣體積20μl;實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)法定量。

2.3.3 結(jié)果判定 樣品出峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品比較，確定ATP成分并制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)曲線峰面積及細(xì)胞質(zhì)量計(jì)算各組心肌細(xì)胞ATP的含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 心肌細(xì)胞形態(tài)及鑒別結(jié)果

心肌細(xì)胞在培養(yǎng)24h開(kāi)始伸展，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞聚集成團(tuán)生長(zhǎng)，開(kāi)始出現(xiàn)收縮運(yùn)動(dòng)，3d后細(xì)胞有節(jié)律的收縮運(yùn)動(dòng)，成簇細(xì)胞尤為顯著。細(xì)胞免疫化學(xué)證實(shí)，99%以上的細(xì)胞為陽(yáng)性染色細(xì)胞，只有極個(gè)別細(xì)胞不著色。證實(shí)原代培養(yǎng)的細(xì)胞純度很高，因此用該細(xì)胞進(jìn)行的試驗(yàn)是可靠的。

3.2 黃芪組分對(duì)肥大心肌細(xì)胞ATP含量的影響

3.2.1 ATP的定性分離 樣品出峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品相近(圖1、2)，心肌細(xì)胞樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)品后出峰增高(圖3)，由此可以確定心肌細(xì)胞色譜圖中ATP的成分。

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在選定的分析條件下，按外標(biāo)定量法，ATP質(zhì)量濃度為0.25～50.54ug·ml－1，濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系，回歸方程、相關(guān)系數(shù)為Y=14361X+31357，R2=0.9995(n=8)。

圖1 正常樣品

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品

圖3 樣品+標(biāo)準(zhǔn)品

3.2.3 精密度 日內(nèi)和日間精密度實(shí)驗(yàn)均含低、中、高3種濃度，日內(nèi)實(shí)驗(yàn)各濃度在1d內(nèi)分別進(jìn)樣5次，日間實(shí)驗(yàn)各濃度每天進(jìn)樣1次，連續(xù)觀測(cè)5d。結(jié)果表明，日內(nèi)和日間均可獲得較好的重復(fù)性，二者相對(duì)偏差(RSD)分別在0.4%和2.1%以下。

3.2.4 回收率 在已知濃度的樣品中，分別加入低、中、高3種不同濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)品，按樣品測(cè)試方法測(cè)定其加樣回收，測(cè)得回收率為87.2%～118.5%(n=3)。

3.2.5 黃芪組分對(duì)肥大心肌細(xì)胞ATP含量的影響 表1顯示，24h各組心肌細(xì)胞ATP含量無(wú)顯著性差異;48h模型組ATP含量增加，與正常組比較差異顯著;絡(luò)沙坦組、黃芪皂苷、黃芪多糖及黃芪皂苷多糖組ATP含量也有所增加，其中絡(luò)沙坦組、黃芪皂苷及黃芪皂苷多糖組與正常組比較差異顯著，但各組ATP含量均低于模型組，差異顯著。

表1 黃芪組分對(duì)肥大心肌細(xì)胞ATP含量的影響

表1 黃芪組分對(duì)肥大心肌細(xì)胞ATP含量的影響

注:1)與模型組比較:P＜0.05;2)與正常組比較:P＜0.05

組別藥物終濃度(g/L)ATP含量(ug/g)24h 48h正常對(duì)照組 — 48.890±1.506 48.890±1.5061)模 型 組 — 50.250±0.574 64.917±0.7262)洛 沙 坦 組 10－6 49.980±0.986 60.313±0.7721)2)黃芪皂苷組 10－2 48.637±0.117 59.653±0.5901)2)黃芪多糖組 10－2 49.867±0.630 50.113±0.1991)皂苷+多糖組 10－2 49.277±0.609 59.900±0.6361)2)

4 討論

4.1 ATP是心肌收縮的直接供能物質(zhì)

心肌代謝能量的來(lái)源主要是ATP等高能磷酸鍵，而線粒體是氧化代謝產(chǎn)生能量的主要細(xì)胞器官，它的主要功能是生產(chǎn)、儲(chǔ)存ATP。呼吸鏈及氧化磷酸化的酶類(lèi)均集合于線粒體內(nèi)膜上，呼吸鏈的主要成分還原型煙酰胺二核苷酸(NADH)脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、鐵硫蛋白、細(xì)胞色素b、c1、c、a、a3等在傳遞電子的同時(shí)，會(huì)使線粒體內(nèi)膜形成質(zhì)子(H+)跨膜電化學(xué)電位差，線粒體合成酶F1－F0復(fù)合體就可借此電位差進(jìn)行ADP磷酸化生成ATP，使ADP磷酸化生成ATP是線粒體最重要的功能之一。線粒體合成酶F1－F0復(fù)合體即H+_ATP酶體系的生理功能在于利用膜內(nèi)電子傳遞所產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)能而合成ATP，其主要由兩部分組成，球狀的頭部與柄是亞單位F1，埋于內(nèi)膜內(nèi)的底部則為亞單位F0。F1亞單位由α、β、γ、δ、ε5種多肽鏈組成。β肽是具有催化活性的部位，γ肽可能是控制質(zhì)子通過(guò)的閘門(mén)。實(shí)際上，F(xiàn)1亞單位是Ca2+，Mg2+-ATP酶復(fù)合物，具有ADP和ATP結(jié)合部位，經(jīng)常有ADP和ATP牢固地結(jié)合在其上。一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)上結(jié)合的ATP被移向胞質(zhì)，另一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的ADP即被磷酸化形成新的ATP，重新占據(jù)ATP結(jié)合位點(diǎn)。

4.2 心肌肥厚時(shí)心肌組織ATP含量下降

心肌肥厚時(shí)，心臟不僅收縮、舒張功能異常，心肌細(xì)胞的收縮(耗能)結(jié)構(gòu)、產(chǎn)能結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變，且心肌微循環(huán)功能受損，因此肥厚心肌的能量代謝必然受到影響。在靜息狀態(tài)下，肥厚心肌ATP含量下降42%，PCr下降58%，總肌酸含量降低24%，PCr/ATP比值降低32%，ADP升高85%。肥厚心肌ATP和肌苷含量減少的原因及具體機(jī)制尚不清楚，可能與下列因素有關(guān)，包括腺苷酸前體的減少，心肌細(xì)胞膜損傷致攝取能力降低，線粒體/肌原纖維比值和毛細(xì)血管與線粒體之間的彌散距離的變化等，尤其可能與心肌細(xì)胞本身產(chǎn)能機(jī)制的改變有關(guān)，即肥厚心肌糖酵解活性升高，心肌細(xì)胞更多地選擇葡萄糖而不是游離脂肪酸作為氧化供能底物。在底物可獲得量減少的情況下，使ATP產(chǎn)量減少。

4.3 黃芪組分配伍對(duì)肥大心肌細(xì)胞ATP含量的影響

黃芪是1味傳統(tǒng)的補(bǔ)氣藥，現(xiàn)代藥理研究證明，黃芪含有皂苷、多糖、黃酮和微量元素等多種成分，具有多方面的藥理作用[13]。特別是具有明顯的心血管作用[14]，可以改善心臟的收縮及舒張功能[15]，臨床常用于治療心力衰竭。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AngⅡ作用于心肌細(xì)胞24h，ATP含量無(wú)變化，48h引起ATP含量增加。黃芪皂苷或黃芪多糖或黃芪皂苷加多糖作用于AngⅡ致乳鼠肥大心肌細(xì)胞后48h，ATP含量高于正常組，但低于模型組，這是黃芪干預(yù)作用的結(jié)果，說(shuō)明黃芪組分及組分配伍可在分子水平上抑制AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞能量代謝的影響，提示黃芪組分可能是通過(guò)對(duì)肥大心肌細(xì)胞能量代謝的干預(yù)作用預(yù)防心衰的發(fā)生發(fā)展，這就為黃芪防治心力衰竭提供了客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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