王允亮，張 昱△，王洪霞，郝 偉

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院腎病科，北京 100091;2.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)藥理實驗室，北京 100091)

蛋白尿是慢性腎臟病(CKD)的常見臨床表現(xiàn)之一，也是腎臟病進(jìn)行性發(fā)展的重要因素之一[1]。蛋白尿的持續(xù)增多往往導(dǎo)致腎小球硬化，最終出現(xiàn)腎功能衰竭[2]。應(yīng)用有效方法控制和治療蛋白尿是臨床關(guān)注研究的熱點。加味黃芪赤風(fēng)湯是導(dǎo)師張昱主任醫(yī)師創(chuàng)制的治療慢性腎臟病蛋白尿的有效驗方，本實驗采用阿霉素腎病大鼠模型，進(jìn)一步研究加味黃芪赤風(fēng)湯對蛋白尿的確切療效，并從抗自由基損傷的角度探討其作用機理，為本方提供現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

同齡、健康、雄性SD大鼠，體重180g±20g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級動物房。標(biāo)準(zhǔn)食水適應(yīng)性喂養(yǎng)3d。

1.2 藥品與試劑

加味黃芪赤風(fēng)湯(生黃芪、赤芍、防風(fēng)、芡實、地龍、白花蛇舌草等)生藥飲片由中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院提供;洛汀新由北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)(批號X1374);注射用鹽酸多柔比星(速溶性)Pfizer Italia s.r.l.生產(chǎn)(進(jìn)口藥品注冊號 H 20080278，進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)Jx20000016);超氧化物歧化酶、丙二醛試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1.3 方法與分組

實驗第1天將SD大鼠隨機分為空白組(8只，簡稱K組)與阿霉素腎病組(36只)?？瞻捉M尾靜脈一次性注射等量的生理鹽水，并每日灌服等體積生理鹽水;阿霉素腎病組采用尾靜脈一次性注射阿霉素6mg/kg的方法造模，再將阿霉素腎病大鼠隨機分為(1)模型組(9只，簡稱M組):每日灌服等體積生理鹽水;(2)2倍加味黃芪赤風(fēng)湯組(9只，簡稱A組):每日按生藥20.8g/kg以水煎劑灌服;(3)正常劑量加味黃芪赤風(fēng)湯組(9只，簡稱B組):每日按生藥10.4g/kg以水煎劑灌服;(4)洛汀新組(9只，簡稱L組):每日按2mg/kg灌服洛汀新混懸液。各組灌服均從造模后第2周末開始，持續(xù)至實驗第8周末結(jié)束。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 一般狀態(tài) 每日上午9時觀察各組大鼠的大體情況(飲水量、體毛色澤、尾部清潔度、胸腹四肢、睪丸及排便情況)。

1.4.2 24h 尿蛋白定量 實驗第 2、4、6、8 周末將大鼠置于清潔代謝籠中，留取24h尿液，用全自動生化分析儀(日立7600-020)以焦酚紅/鉬酸鹽法測定24h尿蛋白含量。

1.4.3 血生化指標(biāo) 實驗第8周末留尿結(jié)束后，4%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，經(jīng)離心后用全自動生化分析儀(日立7600-020)測定血清白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)和總膽固醇(TCH)。

1.4.4 腎臟皮質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA) 實驗第8周末腹主動脈取血后留取左側(cè)腎臟，做腎臟皮質(zhì)組織勻漿，按試劑盒說明書以硝酸還原酶法進(jìn)行數(shù)值測定。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)

一次性注射阿霉素后，M組、B組、L組分別有1只在實驗第7～10天中死亡。K組大鼠活動自如，毛色光澤，精神狀態(tài)良好，未見四肢腫脹、腹水及睪丸水腫;M組大鼠均有不同程度的體毛缺乏光澤，少動，四肢及睪丸可見水腫，尾部色澤深淺不一，大便偏稀;各給藥組四肢及睪丸水腫程度較M組輕，尾部色澤深淺不一，少數(shù)體毛色澤乏亮。

2.2 對24 h尿蛋白含量的影響

表1顯示，M組大鼠24h尿蛋白量從第2周開始明顯升高，與同期K組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，并且隨著時間的推移大鼠24h尿蛋白定量逐漸增加，至第6周時出現(xiàn)大量蛋白尿;與同期M組相比，A組大鼠24h尿蛋白定量在第4～8周明顯下降(P＜0.05);與同期 M組相比，B組大鼠24h尿蛋白定量在第4周末明顯下降(P＜0.05)，隨后幾周未見統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);與同期 M組相比，L組大鼠24h尿蛋白定量在第4，6周末無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，在第 8周末明顯下降(P＜0.05)。各期各灌藥組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

表1 各組24h尿蛋白比較

表1 各組24h尿蛋白比較

注:與空白組(K)比較:▲▲P＜0.01;與模型組(M)比較:*P＜0.05

group n 2周 4周 6周 8周K 87.13 ± 1.73 9.25 ± 2.89 10.26 ± 1.42 9.74 ± 1.65 M 8 36.43 ±19.41▲▲ 66.92 ±28.99▲▲ 97.74 ±39.18▲▲ 83.89 ±33.53▲▲A 9 32.87 ±19.68▲▲ 36.16 ±19.69▲▲＊ 63.86 ±22.42▲▲＊ 50.11 ±27.72▲▲＊B 8 31.87 ±16.86▲▲ 39.98 ±18.19▲▲＊ 75.98 ±28.67▲▲ 51.40 ±31.79▲▲L 8 36.27 ±13.88▲▲ 44.16 ±21.97▲▲ 64.50 ±29.15▲▲ 41.93 ±22.16▲▲＊

2.3 對血清白蛋白、總蛋白和總膽固醇的影響

表2顯示，與K組相比，M組大鼠血清ALB顯著降低(P ＜0.01)，血清 TCH 顯著升高(P ＜0.01);A組大鼠血清 ALB、血清 TP升高(P＜0.05)，與 M 組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義;B組大鼠血清ALB升高(P＜0.05)，與 M組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;各灌藥組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

表2 各組血清白蛋白、總蛋白、總膽固醇比較

表2 各組血清白蛋白、總蛋白、總膽固醇比較

注:與空白組(K)比較:▲P ＜0.05，▲▲P ＜ 0.01;與模型組(M)比較:*P ＜ 0.05

group n ALB(g/L) TP(g/L) TCH(mmol/L)K 8 34.30 ± 1.31 57.14 ±2.99 1.43 ±0.20 M 8 26.45 ±3.05▲▲ 53.95 ±4.78 5.07 ±1.74▲▲A 9 30.47 ±3.77▲＊ 60.03 ±6.15* 5.00 ±1.28▲▲B 8 30.41 ±3.04▲▲＊58.03 ±5.97 4.53 ±1.87▲▲L 8 29.20 ±2.12▲▲ 55.63 ±5.25 4.58 ±3.25▲

2.4 對腎臟皮質(zhì)超氧化物歧化酶和丙二醛的影響

表3顯示，與 K組相比，M組大鼠腎臟皮質(zhì)SOD降低(P＜0.05)，腎臟皮質(zhì) MDA顯著升高(P＜0.01);與M組相比，A組大鼠腎臟皮質(zhì)SOD顯著升高(P＜0.01)，腎臟皮質(zhì) MDA 降低(P＜0.05);與M組相比，B組大鼠腎臟皮質(zhì)SOD顯著升高(P＜0.01)。

表3 各組腎臟皮質(zhì)超氧化物歧化酶、丙二醛比較

表3 各組腎臟皮質(zhì)超氧化物歧化酶、丙二醛比較

注:與空白組(K)比較:▲P ＜0.05，▲▲P ＜ 0.01;與模型組(M)比較:*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01

group n SOD(U/mg) MDA(nmol/mg)K 8 45.65 ± 2.38 0.28 ± 0.05 M 8 37.07 ± 8.70▲ 0.56 ±0.23▲▲A 9 62.08 ±10.16▲▲＊＊ 0.34 ±0.12*B 8 71.04 ±29.79▲＊＊ 0.43 ±0.21 L 8 42.80 ± 5.75 0.51 ± 0.09▲▲

3 討論

阿霉素腎病模型是目前廣泛應(yīng)用于腎病研究的動物模型，本文依照 Bertani[3]方法復(fù)制阿霉素腎病模型。根據(jù)24h尿蛋白定量，所有腎病模型大鼠2周時均出現(xiàn)蛋白尿，模型組大鼠蛋白尿隨著時間的推移持續(xù)升高，致造模后6周時出現(xiàn)尿蛋白高峰，之后稍有下降，但24h尿蛋白排泄量仍維持在較高的水平。

阿霉素屬于蒽環(huán)類藥物，通過代謝可生成過氧化氫、羥、氧自由基，造成局部自由基堆積，從而損傷腎臟。多數(shù)觀點認(rèn)為，其自由基損傷是造成腎臟足細(xì)胞損傷、足突融合、濾過屏障破壞的機制之一[4]。SOD是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要酶，其含量高低反應(yīng)清除自由基能力大小。MDA為脂質(zhì)過氧化的降解產(chǎn)物，其含量高低則代表脂質(zhì)過氧化的程度。本實驗結(jié)果表明，加味黃芪赤風(fēng)湯能夠顯著降低阿霉素腎病大鼠蛋白尿，提高腎組織SOD水平，降低腎組織MDA水平，改善腎臟自由基損傷。

洛丁新是臨床上西藥用于治療蛋白尿的常用藥物之一。AIPRI[5]研究提示，其具有良好的降低蛋白尿、抑制腎功能惡化的作用。其治療腎臟病的主要機制包括:一是有效降低系統(tǒng)高血壓，同時擴張出球小動脈＞擴張入球小動脈，降低球內(nèi)高壓;二是阻斷AngⅡ，降低腎小球濾過膜孔徑屏障的擴大，減少蛋白尿的濾過;三是可抑制細(xì)胞增生、肥大，減少腎小球細(xì)胞外基質(zhì)蓄積，延緩腎纖維化進(jìn)展。因此，選擇該藥作為陽性對照藥來觀察對蛋白尿的療效。本實驗結(jié)果提示，洛丁新在第8周時對蛋白尿的降低作用與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義，而洛丁新組腎組織SOD、MDA的變化與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，這與其作用機制有關(guān)。應(yīng)該指出的是，作為西藥治療蛋白尿的常用藥物，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI類)和血管緊張素受體拮抗劑(ARB類)已廣泛應(yīng)用于臨床，并得到了肯定的療效，選擇ACEI類藥物洛丁新作為本實驗的陽性對照藥是可行的;正是由于中西藥物的不同作用機制，才導(dǎo)致了在疾病治療上的不同效果。

黃芪赤風(fēng)湯出自清·王清任《醫(yī)林改錯》，由黃芪、赤芍、防風(fēng)組成，用于治療氣血痹阻所致癱腿諸疾，“能使周身之氣通而不滯，血活而不瘀”[6]。臨床應(yīng)用加味黃芪赤風(fēng)湯治療慢性腎臟病蛋白尿療效顯著[7]。方中重用生黃芪益氣補虛?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪富含微量元素硒以及黃酮、皂苷、多糖等有效成分，是參與清除自由基、抗氧化的重要物質(zhì)[8-9];防風(fēng)輕用，剔除腎絡(luò)風(fēng)邪，具有免疫增強、抗氧化、抗凝等功效。與黃芪配伍，更能增強黃芪的功效;赤芍、地龍活血化瘀，增加腎血流量，具有增強免疫力，改善高凝狀態(tài)，清除自由基，抑制和排除免疫復(fù)合物的作用;芡實健脾升清，補腎澀精，調(diào)節(jié)血脂，減少蛋白尿;白花蛇舌草清熱利濕解毒，具有免疫增強作用，能刺激單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)增生和增強吞噬細(xì)胞活力，從而達(dá)到抗感染作用，還有一定的抗氧化作用。諸藥配伍，既能健脾補腎，又可祛風(fēng)利水、活血解毒，共奏標(biāo)本兼治、虛實同調(diào)之功。

[1]Lea J，Greene T，Hebert L，et al.The relationship between magnitude of proteinuria reduction and risk of end-stage renal disease:Results of the African American Study of Kidney Disease and hypertension[J].Arch Intern Med.2005，165:947-953.

[2]劉 紅.蛋白尿與慢性腎臟病變的進(jìn)展[J].腎臟病與透析腎移植雜志，1997，6(4):357-362.

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[4]匡裕玖，周建華.氧自由基在大鼠阿霉素腎病發(fā)生中的作用探討[J].中華醫(yī)學(xué)研究雜志，2004，4(2):103-105.

[5]The GISEN Group.Randomised placebo-controlled trial of effect of ramipril on decline in glomerular filtration rate and risk of terminal renal failure in proteinuric，non diabetic nephropathy[J].Lancet，1997，349:1857-1863.

[6]王清任.醫(yī)林改錯[M].北京:人民軍醫(yī)出版社，2007.73.

[7]張 昱.加味黃芪赤風(fēng)湯治療慢性腎炎蛋白尿50例臨床觀察[J].中醫(yī)中藥，2007，4(36):137.

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