徐 荔，何小鵑，柴 旺，鞠大宏，呂愛平，喻長遠(yuǎn)△

(1.北京化工大學(xué)，北京 100029;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700;3.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

黃芪是常用的“扶正固本，補益中氣”藥物，其化學(xué)成分復(fù)雜，含有多糖、多種皂甙、黃酮以及氨基酸、亞油酸、生物堿等。其中黃芪多糖(Astragalus Polysaccharide，APS)是黃芪中含量最多、免疫活性最強(qiáng)的一類物質(zhì)，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、擴(kuò)張冠狀動脈、改善心臟功能、增強(qiáng)抗氧化能力、防止脂質(zhì)過氧化、改善腎臟功能、防止肝糖原減少、抗衰老等多種功能及藥理功效[1～3]。本實驗以人單核巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞為研究對象，采用體外培養(yǎng)方法，觀察黃芪多糖對LPS誘導(dǎo)的U937細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β及一氧化氮(NO)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

U937細(xì)胞(購自北京協(xié)和醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心);RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibcol公司);胎牛血清(美國Gibcol公司);雙抗(美國Sigma公司);脂多糖(lipoplysaccharide，LPS)(美國Sigma公司);佛波酯(Phorbolmyristateacetate，PMA)(美國Sigma公司);Human TNF-α Instant ELISA，Human IL-1β Instant ELISA試劑盒(美國eBioscience公司);Griess Reagent System試劑盒(美國Promega公司);黃芪多糖(天津賽諾制藥有限公司，批號081201)。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);酶標(biāo)分析儀(美國Thermo公司);以上均為中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所儀器。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) U937細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.3.2 ELISA檢測TNF-α、IL-1β含量 選對數(shù)生長期的U937細(xì)胞，用RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至4×105/ml接種于24孔板，每孔1ml，加PMA誘導(dǎo)48h成熟后，吸棄全部上清液，實驗組每孔加入1ml LPS(1μg/ml)，另設(shè)對照組加入1ml RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中作用1h后，實驗組加入不同濃度的APS 200μl，使其終濃度為37.5μg/ml～150μg/ml，不加APS的LPS組及對照組每孔加入200μl PBS，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。24h后收集各組細(xì)胞上清液，采用酶聯(lián)試驗免疫吸附(ELISA)實驗，測定各組細(xì)胞上清液中TNF-α，IL-1β的含量。方法均按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，于酶標(biāo)儀上測定450nm時的吸光度值。每孔設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。

1.3.3 NO含量 選對數(shù)生長期的U937細(xì)胞，用RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至4×105/ml接種于24孔板，每孔1ml，加PMA誘導(dǎo)48h成熟后，吸棄全部上清液，實驗組每孔加入1ml LPS(1μg/ml)，另設(shè)對照組加入1ml RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中作用1h后，實驗組加入不同濃度的APS 200μl，使其終濃度為37.5μg/ml～150μg/ml，不加APS的LPS組及對照組每孔加入200μl PBS，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。24h后收集各組細(xì)胞上清液，采用Griess檢測法測定各組細(xì)胞上清液中NO的含量。方法均按NO試劑盒說明書進(jìn)行，于酶標(biāo)儀上測定540nm時的吸光度值。每孔設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 U937細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)成熟

圖1顯示，常規(guī)培養(yǎng)的U937細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，將其培養(yǎng)在含有10ng/mlPMA的培養(yǎng)基中，48h后90%細(xì)胞貼壁，從懸浮生長變?yōu)橘N壁生長，并呈典型的巨噬細(xì)胞形態(tài)。

2.2 APS對LPS誘導(dǎo)的U937細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的影響

圖1 PMA誘導(dǎo)U937成熟(40×)

表1顯示，LPS作用于PMA誘導(dǎo)的U937巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中的 TNF-α含量明顯增加，與對照組比較，具有顯著差異(P＜0.01)。APS各濃度組細(xì)胞上清液中的TNF-α含量明顯低于 LPS組(P ＜0.05)，其中當(dāng) APS 終濃度為 75μg/ml和150μg/ml時，細(xì)胞上清液中的TNF-α含量顯著低于LPS組(P ＜0.01)。

表1 APS對LPS誘導(dǎo)的U937細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的影響

2.3 APS對LPS誘導(dǎo)的 U937細(xì)胞產(chǎn)生 IL-1β的影響

表2顯示，LPS作用于PMA誘導(dǎo)的U937巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中的IL-1β含量明顯增加，與對照組比較，具有顯著差異(P＜0.05)。APS各濃度組細(xì)胞上清液中的IL-1β含量明顯低于LPS組(P＜0.05)，其中當(dāng) APS終濃度為 75μg/ml和 150μg/ml時，細(xì)胞上清液中的 IL-1β含量顯著低于 LPS組(P ＜0.01)。

2.4 APS對LPS誘導(dǎo) U937細(xì)胞產(chǎn)生NO影響

表3顯示，LPS作用于PMA誘導(dǎo)的U937巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中的NO含量明顯增加，與對照組比較，具有顯著差異(P＜0.01)。APS各濃度組細(xì)胞上清液中的 NO含量明顯低于 LPS組(P＜0.01)。

表2 APS對LPS誘導(dǎo)的U937細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β的影響

表3 APS對LPS誘導(dǎo)的U937細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響

3 討論

黃芪是常用的益氣健脾中藥之一，黃芪多糖是黃芪的一種重要的單體成分。黃芪多糖是一種免疫調(diào)節(jié)劑，可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，從而增強(qiáng)機(jī)體抗炎和抗病毒效應(yīng)。本研究首先檢測了黃芪多糖對U937細(xì)胞活力的影響，確定對U937細(xì)胞活力影響不明顯的濃度范圍，進(jìn)行后續(xù)正式實驗。結(jié)果表明，黃芪多糖濃度為 37.5μg/ml～150μg/ml時對 U937的活力影響不明顯(數(shù)據(jù)未列出)，因此我們采用該濃度范圍內(nèi)(37.5μg/ml～150μg/ml)的黃芪多糖進(jìn)行后續(xù)實驗研究。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，具有抗腫瘤、抗感染和免疫調(diào)節(jié)等重要作用，在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，并參與特異性免疫應(yīng)答[4]。正常情況下，巨噬細(xì)胞通過吞噬異物、細(xì)菌、衰老和突變細(xì)胞以維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)，同時活化的單核巨噬細(xì)胞能分泌大量的趨化因子和炎癥因子，參與機(jī)體固有和獲得性免疫調(diào)節(jié)[5]。近年來的研究表明，活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生近百種的活性物質(zhì)，如 TNF-α、IL-1β、NO等，其中許多與免疫應(yīng)答及炎癥有關(guān)。TNF-α和IL-1β等為前炎癥細(xì)胞因子或早期細(xì)胞因子，是啟動炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子。TNF-α是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生最早的炎癥介質(zhì)，起最核心的作用[6]。TNF-α的出現(xiàn)能誘發(fā)機(jī)體代謝和血流動力學(xué)明顯變化，促進(jìn)炎癥介質(zhì)生成。IL-1β主要存在于血循環(huán)中，能誘導(dǎo)出與 TNF-α相似的生理和代謝改變，且能與TNF-α產(chǎn)生相互協(xié)同作用引起血管擴(kuò)張和白細(xì)胞介導(dǎo)的組織壞死，從而導(dǎo)致器官衰竭[7]。NO廣泛分布于生物體的各組織器官，參與機(jī)體多種重要的生理病理活動。最新的研究表明，NO具有廣泛的免疫學(xué)意義，其作為炎癥介質(zhì)參加體內(nèi)免疫應(yīng)答反應(yīng)[8]。本實驗利用 LPS體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子并使用黃芪多糖干預(yù)，觀察黃芪多糖對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響。結(jié)果表明，黃芪多糖能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β及 NO，提示黃芪多糖可能用于炎癥等相關(guān)疾病的治療。

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