劉燁 駱文龍 陳利濤

面神經(jīng)周?chē)斡捎谄湮恢帽頊\，外傷、炎癥、手術(shù)和腫瘤等易造成其損傷，而目前面神經(jīng)損傷后的治療仍是臨床醫(yī)學(xué)中所面臨的難點(diǎn)問(wèn)題之一。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為面神經(jīng)損傷后修復(fù)的難點(diǎn)主要有以下兩點(diǎn)[1]：一是如何防止面神經(jīng)損傷后的神經(jīng)元死亡，即如何替代已經(jīng)死亡的神經(jīng)細(xì)胞；二是如何抑制面神經(jīng)損傷后失神經(jīng)支配的骨骼肌纖維化，從而有利于神經(jīng)軸突再生及其收縮功能的恢復(fù)。前者目前最理想的方法只有通過(guò)干細(xì)胞移植，然而很難用于臨床；后者則通過(guò)抑制面神經(jīng)損傷后面頰肌的纖維化來(lái)實(shí)現(xiàn)，相對(duì)于前者可行性更高。文獻(xiàn)報(bào)道[2]肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)通過(guò)促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖、抑制上皮細(xì)胞凋亡及促進(jìn)膠原降解、抑制膠原合成，參與肝、腎、心、肺等多種器官的結(jié)構(gòu)重建，起器官保護(hù)作用，是少數(shù)能夠阻止器官纖維化的生長(zhǎng)因子之一。既往研究[3，4]從形態(tài)學(xué)、神經(jīng)電生理方面證實(shí)外源性的HGF(10 μl)對(duì)面神經(jīng)損傷后神經(jīng)干、神經(jīng)元、肌運(yùn)動(dòng)終板都有保護(hù)作用。Yuichi等[5]從功能上和組織學(xué)上觀察到轉(zhuǎn)基因的HGF能促進(jìn)撕脫傷后的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立面神經(jīng)鉗夾傷模型，利用免疫組化及Western blot技術(shù)，研究HGF對(duì)面神經(jīng)損傷后面頰肌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β，最強(qiáng)的促膠原生成因子)的影響，探討HGF是否能通過(guò)抑制面頰肌的纖維化來(lái)實(shí)現(xiàn)其對(duì)神經(jīng)損傷的保護(hù)作用及其具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑與設(shè)備 玻璃勻漿器(寧波新芝DY89-1)、高速離心機(jī)(湖南湘儀H1650-W)、分光光度儀(上海欣茂UV-7504)、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置(上海天能生物)、電泳儀(北京君意JY300C)、多用脫色搖床(蘇州捷美SYC-2101)，單去污劑裂解液(北京普利萊生物)、0.01 mol/L PBS (pH 7.3)、10%分離膠、4%濃縮膠、0.15 mol/L NaCl 溶液、5XSDS 上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、封閉液、TBST、TBS、顯影液、定影液、抗體、化學(xué)發(fā)光試劑，鼠抗-TGF-β(購(gòu)于上海sigma公司)二抗試劑盒(購(gòu)自Dako公司)，重組人類(lèi)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子1mg(購(gòu)于百萃生物科技有限公司)。

1.2動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)方法 30只SD大鼠(體重220～280 g)購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的環(huán)境，自由進(jìn)食。隨機(jī)分成三組：對(duì)照組、生理鹽水組和HGF組，每組10只。

1.2.1面神經(jīng)鉗夾傷模型的建立[6]及治療 三組動(dòng)物分別制作右側(cè)面神經(jīng)鉗夾傷模型，動(dòng)物以10%水合氯醛腹腔注射(3 ml/kg)麻醉后，切開(kāi)皮膚、皮下組織，仔細(xì)分離右側(cè)面神經(jīng)頰支，用顯微外科鑷鉗夾其近心端(以鑷子第一扣為準(zhǔn)，均為同一實(shí)驗(yàn)者操作)10秒鐘后，HGF組和生理鹽水組分別在面神鉗夾處周?chē)钊虢MHGF或生理鹽水10 μl的醫(yī)用膠原蛋白海綿塊，然后逐層縫合，術(shù)后連續(xù)3天腹腔注射青霉素預(yù)防感染，對(duì)照組不做任何治療。連續(xù)觀察大鼠胡須的運(yùn)動(dòng)方向1個(gè)星期(初步判斷面神經(jīng)的損傷程度)。1月后(既往研究證實(shí)面神經(jīng)損傷后1月左右面頰肌纖維化最明顯)[3,4]取右側(cè)面頰肌，行免疫組化染色及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGF-β的表達(dá)。

1.2.2免疫組化方法 10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，迅速取完整大鼠面頰肌，稱(chēng)重后放入多聚甲醛4 ℃冰箱保存24小時(shí)，常規(guī)脫水、包埋、切片。免疫組化染色步驟為：①常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水；②過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；③抗原修復(fù)；④抗原封閉；⑤加適當(dāng)稀釋一抗(50 μl)；⑥滴加二抗；⑦滴加HPR液；⑧滴加DAB顯色液、復(fù)染、封片，各步驟之間用0．01 mol/L PBS充分洗滌；⑨復(fù)染，每只大鼠在相似層面各取1～3張片子，利用顯微圖像分析系統(tǒng)，在200倍物鏡下，對(duì)面頰肌TGF-β表達(dá)平均光密度進(jìn)行計(jì)算分析(陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色或棕褐色，背景為藍(lán)色)。

1.2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 按照蛋白提取液說(shuō)明書(shū)提取蛋白。取適量蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后在5%的脫脂牛奶中進(jìn)行封閉，然后加鼠抗-TGF-β(1：3 000)，溫育1.5小時(shí)。用TBST清洗3次，每次5分鐘，用封閉液將二抗稀釋成一定的濃度(1:5 000)，溫育1.5小時(shí)，用TBST清洗4次，每次5分鐘?；瘜W(xué)發(fā)光，顯影，定影，對(duì)膠片進(jìn)行掃描，最后用UVP凝膠圖像處理系統(tǒng)Labworks4.6軟件分析目的條帶的灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1面神經(jīng)鉗夾傷后HGF對(duì)面頰肌濕重的影響 對(duì)照組面頰肌濕重為1.954±0.119 g，與生理鹽水組(1.952±0.104 g)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)),HGF組面頰肌濕重為1.791±0.095 g，與前兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2HGF對(duì)面頰肌TGF-β表達(dá)的影響 HGF組面頰肌肌纖維比較清晰，TGF-β有散在表達(dá)，而對(duì)照組、生理鹽水組面頰肌肌纖維排列較雜亂，TGF-β表達(dá)聚集(圖1)。HGF組TGF-β免疫化學(xué)累計(jì)光密度明顯低于對(duì)照組及生理鹽水組(P<0.01)，而對(duì)照組與生理鹽水組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 三組TGF-β免疫化學(xué)累積光密度

注：與其他兩組比較，P<0.01

2.3Western blot檢測(cè)TGF-β蛋白表達(dá)結(jié)果 West blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HGF可抑制TGF-β蛋白的表達(dá)，生理鹽水對(duì)TGF-β無(wú)明顯影響(圖2)。用Labworks4.6軟件分析TGF-β蛋白的相對(duì)表達(dá)率，對(duì)照組、生理鹽水組、HGF組TGF-β蛋白的相對(duì)表達(dá)率分別為36.4%±4.4%、36.7%±3.8%、15.1%±2.9%，HGF組較對(duì)照組及生理組TGF-β蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.01)，而生理鹽水與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 三組動(dòng)物面頰肌 TGF-β表達(dá)情況 a 對(duì)照組；b 生理鹽水組;c HGF組。箭頭所示為T(mén)GF-β陽(yáng)性表達(dá)(SP×200)

圖2 Western blot檢測(cè)三組面頰肌TGF-β蛋白的表達(dá)

3 討論

HGF屬于纖溶酶原依賴(lài)的生長(zhǎng)因子家族，是一種可溶性的細(xì)胞因子，最初認(rèn)為它僅能刺激肝細(xì)胞增生，現(xiàn)已被證實(shí)其具有多種功能，在全身多處均有表達(dá)，它不僅是神經(jīng)外組織細(xì)胞的分裂原、運(yùn)動(dòng)因子、成型索，而且還對(duì)大腦及外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持、軸突靶向分布以及軸突生長(zhǎng)有一定作用。HGF可以通過(guò)自分泌、旁分泌以及經(jīng)典的軸突逆向運(yùn)輸?shù)姆绞奖Ｗo(hù)神經(jīng)元和軸突再生，促進(jìn)雪旺細(xì)胞的分裂，抑制纖維瘢痕的生長(zhǎng)[7]。神經(jīng)損傷后HGF在中樞分泌較少，而在靶組織大量增加，故在外周神經(jīng)損傷時(shí)，局部應(yīng)用HGF更有意義[8]。哈小琴等[9]報(bào)道局部應(yīng)用HGF可促進(jìn)皮膚愈合，還可促進(jìn)皮膚中附屬器的形成，故本實(shí)驗(yàn)采用局部應(yīng)用HGF觀察其對(duì)面神經(jīng)損傷后修復(fù)的影響。

目前研究[10]認(rèn)為T(mén)GF-β是最強(qiáng)的促膠原生成因子，與心、肝、腎纖維化進(jìn)程密切相關(guān)，其作用表現(xiàn)在活化的TGF-β能使腎小管上皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和心肌細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞，促進(jìn)其生成大量纖維蛋白和I型、Ⅲ型膠原蛋白，同時(shí)抑制膠原酶釋放，阻滯基質(zhì)蛋白降解，使細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡，最終發(fā)生心、肝、腎等器官纖維化。任國(guó)山等[11]研究表明，HGF對(duì)新生大鼠受損的面運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有保護(hù)作用。 Mou等[12]發(fā)現(xiàn)HGF通過(guò)減少腎臟TGF-β的表達(dá)來(lái)抑制腎臟的纖維化。大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)[13～15]在心臟、肺、肝臟，HGF同樣通過(guò)抑制TGF-β的表達(dá)減少器官的纖維化，從而促進(jìn)器官的功能修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)在大鼠面神經(jīng)損傷后局部使用HGF同樣是擬通過(guò)抑制面頰肌的纖維化來(lái)促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)在大鼠面神經(jīng)鉗夾傷后局部應(yīng)用HGF，通過(guò)比較三組面頰肌濕重、免疫組織化學(xué)染色和Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HGF組TGF-β蛋白表達(dá)較對(duì)照組及生理鹽水組明顯減少，可見(jiàn)，HGF可通過(guò)減少失神經(jīng)支配后面頰肌TGF-β的表達(dá)來(lái)抑制面頰肌的纖維化，從而促進(jìn)面神經(jīng)損傷后的修復(fù)，這對(duì)臨床上局部應(yīng)用HGF治療各種面神經(jīng)損傷具有重要意義，但HGF對(duì)TGF-β整個(gè)信號(hào)通路存在何種影響以及HGF是否還通過(guò)減弱其它膠原生成因子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)神經(jīng)損傷后的修復(fù)，有待進(jìn)一步研究。

(致謝：衷心感謝重慶醫(yī)科大學(xué)附動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的全體老師在實(shí)驗(yàn)中給予的無(wú)私幫助！)

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