王亞琴，陳興瑤，陽成偉

(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006;2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院//廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510631)

擬南芥CPR5基因 (AtCPR5)是一個(gè)多 效性基因，在擬南芥抗病性、細(xì)胞增殖、細(xì)胞衰老、細(xì)胞死亡、蔗糖的感受、茉莉酸途徑、脫落酸途徑、膜蛋白的編輯、細(xì)胞壁形成等方面發(fā)揮重要的作用［1－5］。此外AtCPR5基因還影響擬南芥細(xì)胞壁的形成及表皮毛的發(fā)生［5］。最近的研究發(fā)現(xiàn)AtCPR5與擬南芥的耐熱性密切相關(guān)，過量表達(dá)AtCPR5能提高擬南芥的耐熱性，而且初步闡明其調(diào)節(jié)機(jī)制可能是通過上調(diào)熱激蛋白hsp17.6的表達(dá)而間接提高了擬南芥的耐熱性［6］。

水稻Oryza sativa是世界上分布最廣、最重要的的糧食作物之一，其遺傳轉(zhuǎn)化育種在抗蟲、抗病、抗除草劑、抗旱、耐鹽、改善品質(zhì)、提高產(chǎn)量等方面都有應(yīng)用［7］，但在水稻耐高溫等方面研究較少。水稻生長(zhǎng)的最適溫度為25～31℃［8］，在生長(zhǎng)和發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均對(duì)高溫脅迫敏感［9－10］。目前，伴隨全球工業(yè)化進(jìn)程的加速，溫室效應(yīng)的加劇，21世紀(jì)全球溫度預(yù)計(jì)會(huì)升高1.5～4.5℃，高于20世紀(jì)3～9倍［11］。而日平均氣溫每升高1℃，水稻產(chǎn)量至少下降10%［12］，極端高溫出現(xiàn)頻率大幅度提高會(huì)給水稻等農(nóng)作物的安全生產(chǎn)帶來極大的隱患［13］。尤其近幾年我國(guó)南方和西南大部分地區(qū)高溫干旱導(dǎo)致水稻產(chǎn)量驟減。因此，開展水稻耐熱性研究以培育水稻耐高溫品種已成為當(dāng)前水稻遺傳育種的重要課題，這對(duì)穩(wěn)定水稻產(chǎn)量具有重大意義。本文利用近年來水稻遺傳轉(zhuǎn)化中常用品種中花11(Oryza sativa L.subsp.japonica)為材料，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pHQSN1-AtCPR5轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株，為水稻耐高溫品種的選育作一基礎(chǔ)性研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 中花11(Oryza sativa L.subsp.japonica)成熟胚，由中國(guó)科學(xué)院華南植物園提供。野生型 (Columbia生態(tài)型)擬南芥Arabidopsis thaliana購(gòu)于美國(guó)擬南芥生物資源中心 (Arabidopsis Biological Resource Center，USA)，經(jīng)繁殖后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 質(zhì)粒和菌種 pMD20-T vector:TaKaRa，Guangzhou，China.pHQSN1質(zhì)粒、E.coli DH5α 大腸桿菌、EHA105根癌農(nóng)桿菌:由華南師范大學(xué)提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 大腸桿菌和農(nóng)桿菌活化培養(yǎng)分別采用LB和YEP固體培養(yǎng)基［14－15］;農(nóng)桿菌工程菌液的制備采用 AAI液體培養(yǎng)基［15］，附加200 μmol/L AS。愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基 (NBB):N6大量元素+B5微量元素+B5有機(jī)成份+2 mg/L 2，4-D+0.3 g/L水解酪蛋白+0.5 g/L脯氨酸+30 g/L蔗糖+3.5 g/L植物凝膠，PH 5.8。

共培養(yǎng)基:NBB+0.3 g/L水解酪蛋白+0.5 g/L 脯氨酸+2 mg/L 2，4-D+200 μmol/L AS+10 g/L葡萄糖+30 g/L蔗糖+3.5 g/L植物凝膠，pH 5.5。

選擇培養(yǎng)基:NBB+1 g/L水解酪蛋白+1 g/L脯氨酸+2 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+50 mg/L Hyg(潮霉素)+500 mg/L Cef(頭孢霉素)+3.5 g/L植物凝膠，pH 5.8。

預(yù)分化培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+1 g/L水解酪蛋白+2 mg/L 2，4-D+50 mg/L Hyg+20 g/L蔗糖+3.5 g/L植物凝膠，pH 5.8。

分化培養(yǎng)基:N6大量元素+MS微量元素+B5有機(jī)成分+5 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+50 mg/L Hyg+15 g/L蔗糖+3.5 g/L植物凝膠，pH 5.8。

生根培養(yǎng)基:1/2 MS培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+1 mg/LIBA+3.5 g/L植物凝膠，pH 5.8。

1.2 方法

1.2.1 AtCPR5基因的擴(kuò)增和植物雙元表達(dá)載體的構(gòu)建 提取野生型擬南芥葉片RNA，設(shè)計(jì)帶有BamH I酶切位點(diǎn)的兩個(gè)引物 (CPR5-F:5'-GG ATCCCATGGAAGCCCTCCTCCT-3';CPR5-R:5'-GGATCCTCAAGCATAGTCAGACCCACC AT-3')，進(jìn)行AtCPR5基因 (1 695 bp)的擴(kuò)增。將AtCPR5目的片段與pHQSN1表達(dá)載體 (圖1)連接，形成重組質(zhì)粒pHQSN1-AtCPR5。

圖1 植物雙元表達(dá)載體pHQSN1示意圖Fig.1 The plant expression binary vector of pHQSN1

1.2.2 水稻再生體系的建立 選取籽粒飽滿、大小一致的中花11成熟種子，37℃烘12 h，去殼，表面消毒后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每平板接種約30個(gè)成熟胚。

為探索愈傷組織誘導(dǎo)和再生適宜的溫度和光照條件，設(shè)計(jì)27℃、暗，27℃、光 (光強(qiáng)為80 μmol·M－2·s－1)，32 ℃、暗，32℃、光4個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理做15個(gè)重復(fù)。誘導(dǎo)7 d后，隨機(jī)各取10個(gè)平板統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。同時(shí)剝下由成熟胚盾片處長(zhǎng)出的顆粒狀胚性愈傷組織，分別置于4種條件下繼代培養(yǎng)。7 d繼代一次，繼代兩次。將上述4種條件下繼代兩次的愈傷組織分別接入預(yù)分化培養(yǎng)基，27℃、暗培養(yǎng)5～6 d后，27℃、16 h光/8 h暗培養(yǎng)7～8 d。然后接入分化培養(yǎng)基，27℃，16 h光/8 h暗培養(yǎng)7～10 d后即可成苗。待苗長(zhǎng)至3 cm左右時(shí)移至生根培養(yǎng)基，當(dāng)幼苗長(zhǎng)出較多的新根后煉苗，移栽大田種植。

此外還以6－BA和NAA的不同濃度組合篩選了最適的分化培養(yǎng)基。

1.2.3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化 根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化參照李美茹等［15］方法，并稍作改進(jìn)。浸染時(shí)根癌農(nóng)桿菌A600≈0.05～0.1;共培養(yǎng)基上添加1張用AAI培養(yǎng)液浸濕的無菌濾紙，26℃、暗培養(yǎng)3 d。篩選培養(yǎng)時(shí)先進(jìn)行30 mg/L的潮霉素選擇培養(yǎng)，約10 d后將新鮮愈傷組織轉(zhuǎn)移至50 mg/L的潮霉素選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第二次抗性篩選。篩選的培養(yǎng)條件為32℃、持續(xù)光照培養(yǎng)?？剐杂鷤M織的預(yù)分化和分化，方法同1.2.2。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因水稻的分子檢測(cè)

(1)轉(zhuǎn)基因水稻的PCR檢測(cè)。

用冷凍研磨SDS法分別提取WT和轉(zhuǎn)化植株總DNA，進(jìn)行AtCPR5基因全長(zhǎng)和潮霉素基因片段(500 bp)的PCR檢測(cè)。潮霉素基因片段引物序列如下:

HPT－F:5'－ ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGC－3'

HPT－R:5'－ TCCATCACAGTTTGCCAGTGATA－3'

擴(kuò)增潮霉素基因片段PCR反應(yīng)條件:94℃ 5 min;95℃ 30 s;58℃ 30 s;72℃ 1 min，30次循環(huán);72℃ 10 min，4℃ 10 h。

(2)轉(zhuǎn)基因水稻的Southern blot檢測(cè)。

大量提取PCR反應(yīng)呈陽性的水稻苗總DNA，用BamH I酶切，電泳，轉(zhuǎn)膜后分別與地高辛標(biāo)記的AtCPR5基因 (探針長(zhǎng)度549 bp)、HPT基因探針 (探針長(zhǎng)度600 bp)雜交，具體步驟見Roche公司的試劑盒使用說明書。

(3)轉(zhuǎn)基因水稻的半定量RT-PCR檢測(cè)。

使用TaKaRa公司的RNAiso Plus試劑，分別提取WT和鑒定為陽性植株的總RNA，用DNA酶進(jìn)行酶解以去除基因組DNA。以水稻actin基因做內(nèi)參，CPR5-F和CPR5-R為擴(kuò)增引物，對(duì)AtCPR5基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況做半定量檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度和光照對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在4種處理?xiàng)l件下誘導(dǎo)的成熟胚，其誘導(dǎo)率的差異很大。其中32℃條件下誘導(dǎo)的成熟胚在第3 d就會(huì)長(zhǎng)出愈傷組織，同時(shí)看到胚芽形成，而27℃條件下誘導(dǎo)的成熟胚出愈時(shí)間會(huì)延遲1～2 d。誘導(dǎo)7 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率見表1。從表1可以看出，32℃培養(yǎng)相比27℃培養(yǎng)誘導(dǎo)率提高約40%，其中32℃、光照培養(yǎng)誘導(dǎo)率最高，而且愈傷組織生長(zhǎng)速度快，體積增長(zhǎng)明顯 (圖2)，用少量的種子即可獲得足夠多的材料用于轉(zhuǎn)化。這與于洋等［16］報(bào)道的高溫培養(yǎng)更有利于成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織早期生長(zhǎng)的結(jié)果相符。同時(shí)從表1還可以看出，相同溫度下，光照和黑暗對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)影響不大，而溫度對(duì)愈傷組織的培養(yǎng)影響卻較大。32℃、光照培養(yǎng)條件下的愈傷組織干爽，出愈時(shí)間提早，誘導(dǎo)率高，是愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的最佳條件。

表1 溫度和光照對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響1)Table 1 The effect of temperature and light on callus induction

圖2 不同溫度、光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織Fig.2 Calli induced under different temperature and light(誘導(dǎo)第28天拍照)

表2 溫度和光照對(duì)愈傷組織分化和再生的影響1)Table 2 The effect of temperature and light on callus differentiation and shoot regeneration

2.2 溫度和光照對(duì)愈傷組織繼代生長(zhǎng)的影響

愈傷組織分別在4種條件下繼代培養(yǎng)14 d后，光照條件下繼代生長(zhǎng)的愈傷組織顏色淡黃，較暗培養(yǎng)的顏色深;27℃培養(yǎng)的愈傷組織較濕潤(rùn)、質(zhì)地較松散，而32℃培養(yǎng)的愈傷組織體積增長(zhǎng)明顯，干爽、較緊湊，顆粒較大而不易破碎，這樣的愈傷組織胚性好，更有利于浸染和分化再生 (圖3)。

圖3 不同溫度、光照條件下繼代的愈傷組織Fig.3 Calli subcultured under different temperature and light(繼代第14天拍照，a:27℃，暗;b:27℃，光;c:32℃，暗;d:32℃，光)

2.3 溫度和光照對(duì)愈傷組織再生的影響

4種不同誘導(dǎo)和繼代處理?xiàng)l件下的愈傷組織經(jīng)過相同條件的預(yù)分化和分化培養(yǎng)后，統(tǒng)計(jì)分化率和再生率 (表2)。27℃和32℃條件下培養(yǎng)的愈傷組織分化率均達(dá)到90%以上，兩者無明顯區(qū)別，但32℃條件下愈傷組織再生率約90%，比27℃條件下的再生率提高約40%。而且32℃、光照條件下的愈傷組織分化率和再生率均比32℃、暗培養(yǎng)高。說明適當(dāng)提高溫度可以提高愈傷組織再生率，這一結(jié)果與于洋等［16］的報(bào)道相符。從圖4可以看出，32℃、光照培養(yǎng)的愈傷組織在分化培養(yǎng)基上幾乎都能分化成苗，相比傳統(tǒng)的26～28℃、暗培養(yǎng)的條件，32℃、光照培養(yǎng)不僅可以提高誘導(dǎo)率、縮短誘導(dǎo)周期，而且分化成苗率高。

圖4 32℃、光照條件下誘導(dǎo)和繼代的愈傷組織在分化培養(yǎng)基上的分化和再生Fig.4 Differentiation and regeneration of calli induced and subcultured under the condition of 32℃and light

2.4 不同的激素配比對(duì)水稻愈傷組織分化和再生的影響

通過上述試驗(yàn)確定32℃、光照培養(yǎng)為愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的最佳條件，為進(jìn)一步研究外源激素6－BA和NAA對(duì)愈傷組織分化和再生的影響，從而優(yōu)化分化培養(yǎng)基，提高再生率。我們將32℃、光照培養(yǎng)條件下繼代兩次的愈傷組織預(yù)分化后，分別接種于不同激素配比的分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)20 d統(tǒng)計(jì)分化率和再生率 (表3)。

結(jié)果表明，隨著6－BA和NAA質(zhì)量濃度的提高，水稻愈傷組織分化率和再生成苗率也提高，其中兩者組合質(zhì)量濃度分別為5 mg/L和1 mg/L時(shí)愈傷組織分化率和再生率達(dá)到最高。其中6－BA是誘導(dǎo)植株再生所必需的外源激素，較高質(zhì)量濃度的6－BA可以誘導(dǎo)更多植株再生，但如果6－BA質(zhì)量濃度過高，會(huì)導(dǎo)致植株發(fā)生玻璃化現(xiàn)象［26］，而NAA能加速愈傷組織的生長(zhǎng)，增加細(xì)胞數(shù)量，積累特異蛋白、糖等必要物質(zhì)，因此，只有兩者分別以5 mg/L和1 mg/L質(zhì)量濃度組合時(shí)可使愈傷組織達(dá)到較優(yōu)的再生效果。

圖5 愈傷組織的抗性篩選Fig.5 Resistant selection of calli(左圖為篩選培養(yǎng)30 d;右圖為篩選培養(yǎng)18 d)

表3 不同植物激素配比對(duì)愈傷組織分化及再生的影響Table 3 The effect of different phytohormone concentration on callus differentiation and shoot regeneration

2.5 抗性植株的獲得

利用根癌農(nóng)桿菌浸染愈傷組織后，先進(jìn)行低質(zhì)量濃度潮霉素 (30 mg/L)的抗性篩選，這有助于促進(jìn)浸染后愈傷組織細(xì)胞的恢復(fù)生長(zhǎng)。且采用32℃、持續(xù)光照的條件，有助于除去共培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌，降低染菌率，促進(jìn)細(xì)胞分裂生長(zhǎng)，使抗性愈傷組織獲得率達(dá)到90.58%(圖5)。篩選后的抗性愈傷組織經(jīng)過再生培養(yǎng)后，共獲得80株T0代抗性水稻植株 (圖6)。

2.4 轉(zhuǎn)基因水稻的分子檢測(cè)

2.4.1 轉(zhuǎn)基因水稻的PCR檢測(cè) 隨機(jī)選取20株T0代抗性植株提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，未轉(zhuǎn)化的對(duì)照無特異性條帶，而20株T0代抗性植株均擴(kuò)增出1 695 bp(圖7 a)和500 bp(圖7 b)的特異性條帶，可初步確定AtCPR5已整合到抗性植株的基因組中。

圖6 抗性愈傷組織再生 (左圖)和抗性苗生根培養(yǎng) (右圖)Fig.6 Regeneration of resistant calli(the left)and rootage of resistant plantlets(the right)

圖7 T0代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)Fig.7 PCR detection of T0transgenic plantlets.M:Maker DL2000;CK+:陽性對(duì)照 (質(zhì)粒);CK－:

2.4.2 轉(zhuǎn)基因水稻的Southern blot檢測(cè) 經(jīng)地高辛標(biāo)記的AtCPR5基因探針和HPT基因探針雜交檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因植株顯示出特征雜交帶，未轉(zhuǎn)基因植株則沒有雜交帶。而且PCR檢測(cè)呈陽性的樣品在Southern雜交中均為陽性，而且是單拷貝插入。

2.4.3 轉(zhuǎn)基因水稻的半定量RT-PCR檢測(cè) 為檢測(cè)AtCPR5基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，分別提取8株轉(zhuǎn)基因水稻的總RNA進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè)。8株轉(zhuǎn)基因水稻均能擴(kuò)增出1 695 bp的特異性條帶，而未轉(zhuǎn)化水稻沒有擴(kuò)增出任何條帶 (圖8)，說明AtCPR5在此8株轉(zhuǎn)基因水稻中均有不同程度的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其中在第5和第8號(hào)植株中表達(dá)較弱。

3 討論

目前，在完善水稻再生體系研究中，對(duì)培養(yǎng)基種類［17－19］、外植體選擇［20－21］、基因型［22－23］、光照條件等研究報(bào)道較多［24－25］。但是水稻作為一種喜溫作物，溫度對(duì)其組織培再生也是一個(gè)非常重要的制約因素。人們?cè)诶盟境墒炫哌M(jìn)行再生培養(yǎng)時(shí)常將培養(yǎng)條件設(shè)定為26～28℃，暗培養(yǎng)［26］。2006年，Seiichi Toki等［27］發(fā)現(xiàn)，32℃，光照培養(yǎng)1 d的日本晴成熟種子可直接用于農(nóng)桿菌浸染，建立了一套適合于日本晴的農(nóng)桿菌早期浸染水稻成熟胚快速轉(zhuǎn)化體系，一個(gè)月內(nèi)就可獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化效率為28.6%。本研究通過根癌農(nóng)桿菌浸染32℃、光照條件下誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的愈傷組織，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到90%，從愈傷組織誘導(dǎo)到獲得轉(zhuǎn)基因抗性苗約2個(gè)月，相比傳統(tǒng)條件下3～4個(gè)月的水稻轉(zhuǎn)化周期，可以節(jié)省1～2個(gè)月;相比Seiichi Toki等人的早期浸染水稻成熟胚快速轉(zhuǎn)化法，雖然周期多一個(gè)月，但轉(zhuǎn)化效率得到了較大的提高。蘇益等［28］為驗(yàn)證Seiichi Toki等人的快速浸染轉(zhuǎn)化法是否適用于中花11成熟胚轉(zhuǎn)化，在愈傷組織預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、浸染時(shí)間和凝固劑等方面做了改進(jìn)，40 d即可獲得水稻轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化效率和再生效率分別為71.3%和57%。而本試驗(yàn)獲得的愈傷組織在優(yōu)化的預(yù)分化和分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)約25 d后，再生率和分化率可達(dá)到90%以上，相比蘇益等人的研究成果，轉(zhuǎn)化率和再生率分別提高近20%和30%。因此，本研究建立起了一套新的適合于中花11再生和轉(zhuǎn)化的體系。利用此體系，筆者還進(jìn)行了OsCPR5基因、OsphyA基因轉(zhuǎn)化中花11的研究，用于研究?jī)蓚€(gè)基因的過量表達(dá)和RNAi干擾等。結(jié)果均表明，該方法具有可行性、穩(wěn)定性、高效性，適合于水稻中花11的遺傳轉(zhuǎn)化研究。

在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方面，目前的文獻(xiàn)研究使用的根癌農(nóng)桿菌菌液A600常為0.1～1.5，轉(zhuǎn)化率約為50% ～80%(粳稻)。但本實(shí)驗(yàn)中使用的菌液A600為0.05～0.1，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)90%，此濃度范圍既可保證較高的轉(zhuǎn)化效率，又可避免因農(nóng)桿菌濃度過高，導(dǎo)致愈傷組織染菌死亡。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)時(shí)添加1張用AAI培養(yǎng)液浸濕的無菌濾紙，不僅可以有效抑制農(nóng)桿菌過度生長(zhǎng)，而且浸染后的愈傷組織狀態(tài)較未添加濾紙的狀態(tài)好，抗性愈傷組織獲得率可提高到90.58%，這與黃健秋等［29］的報(bào)道相符。

本試驗(yàn)前期的研究證明擬南芥多效性基因CPR5具有耐熱功能［6］，為了研究水稻的耐熱性以期選育耐高溫品種，我們將此基因轉(zhuǎn)化水稻獲得轉(zhuǎn)化植株，擬檢驗(yàn)AtCPR5基因能否在水稻中發(fā)揮耐熱功能或者其他抗逆功能，從耐熱生理指標(biāo)方面檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株的耐熱能力從而選育耐高溫品種(數(shù)據(jù)在整理中);同時(shí)我們從水稻中克隆了AtCPR5的同源基因，命名為OsCPR5。構(gòu)建了其啟動(dòng)子表達(dá)載體以及OsCPR5基因的過表達(dá)和RNAi載體，獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)化植株，研究水稻內(nèi)源CPR5基因在水稻中的表達(dá)情況［30］，通過RNAi轉(zhuǎn)化植株和過表達(dá)轉(zhuǎn)化植株在各種脅迫下生理指標(biāo)的測(cè)定，來驗(yàn)證OsCPR5基因是否具有擬南芥CPR5基因在抗病、抗逆、耐熱方面相似的功能，全面解析OsCPR5基因的功能及作用機(jī)理。

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