黃小玲，楊春燕，袁慧文

(1.廣東省深圳市慢性病防治中心，廣東 深圳 518020; 2.廣東省深圳市藥品檢驗(yàn)所，廣東 深圳 518029)

天麻藥材高效液相色譜指紋圖譜研究

黃小玲1，楊春燕1，袁慧文2

(1.廣東省深圳市慢性病防治中心，廣東 深圳 518020; 2.廣東省深圳市藥品檢驗(yàn)所，廣東 深圳 518029)

目的研究天麻藥材的高效液相色譜指紋圖譜，為其質(zhì)量控制提供可靠的方法。方法采用高效液相色譜法。色譜柱為Ultimate XBC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇－1%冰醋酸水溶液(梯度洗脫)，柱溫為30℃，流速1 mL/min，檢測波長270 nm。結(jié)果初步建立了天麻藥材的高效液相色譜指紋圖譜，標(biāo)定出16個(gè)共有峰;天麻素的加樣加收率為102.66%，RSD＜2.5%(n=6)。結(jié)論高效液相色譜指紋圖譜為天麻藥材質(zhì)量控制提供了一種新方法，并為未知天麻樣品的鑒別提供一個(gè)準(zhǔn)確、快捷的工具。

天麻;高效液相色譜法;指紋圖譜;質(zhì)量控制;天麻素

天麻為蘭科多年生草本植物天麻Gastrodia elataBlume的干燥塊莖，味甘、性微溫，具平肝、息風(fēng)、止痙等功效，是我國名貴中草藥之一，在我國分布廣泛。2005年版《中國藥典(一部)》中主要以天麻素含量來評(píng)價(jià)天麻藥材的質(zhì)量[1]。筆者采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)10批不同地區(qū)的天麻藥材進(jìn)行測定，初步建立了高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜，標(biāo)出16個(gè)共有指紋峰;并以天麻素為對(duì)照品，測定比較了不同來源的天麻藥材中天麻素含量，初步評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Waters 1525型二元高效液相色譜儀，包括Waters 2996型二級(jí)管陣列檢測器、Empower 2色譜分析軟件(美國Waters公司)。甲醇(江蘇漢邦科技有限公司，色譜純);甲醇、乙醇、醋酸(汕頭化學(xué)試劑廠，分析純)，其他試劑均為分析純;水為雙蒸水。天麻素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用)，10批天麻樣品來源于全國不同產(chǎn)地，由深圳市藥品檢驗(yàn)所鑒定為蘭科藥用植物天麻。天麻樣品來源TM1為西藏林芝，TM2為高黎貢山(野生)，TM3為云南小草壩，TM4為云南九華公司，TM5為麗江巨甸，TM6為安徽亳州，TM7為安徽大別山，TM8為四川(野生)，TM9為四川(家種)，TM10為陜西略陽九中金，TM對(duì)照為中國藥品生物制品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 天麻素含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Ultimate XB －C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇(A)和1%冰醋酸水溶液(B)，二元梯度洗脫50 min，0～25 min時(shí)，5% ～40%A(V/V)，25～35 min，40% ～80%A(V/V)，35～50 min時(shí)80% ～85%A(V/V);流速:1 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:270 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

2.1.2 溶液配制

取天麻素標(biāo)準(zhǔn)品(干燥至恒重)，用30%甲醇配成0.255 g/L的對(duì)照品溶液。取天麻藥材，粉碎，取60目篩細(xì)粉，精密稱取0.500 g，加入15 mL 30%甲醇，超聲提取30 min，過0.45 μm濾膜，取濾液，加入1%的殼聚糖溶液(以1%冰醋酸為溶劑)，配成15 mL，4℃冰箱過夜，取上清液，即得供試品溶液。

2.1.3 測定方法

分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄50 min的色譜圖。

2.1.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密量取對(duì)照品溶液，用水稀配成0.255～25.500 μg/mL 的系列對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣 20 μL，測定峰面積積分值。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=15 466.11X－2 459.62，r=0.998 8。結(jié)果表明天麻素質(zhì)量濃度在0.255～25.5 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取1號(hào)供試品溶液，進(jìn)樣5次，以15號(hào)峰為參照峰，計(jì)算其他各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果單峰面積占總峰面積10%以上指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別小于 3.0%和 2.5%(n=5)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取1號(hào)供試品溶液(保存于低溫冰箱中)，于配制后 0，2，4，8，12，24，48，72 h 時(shí)分別進(jìn)樣，以 15 號(hào)峰為參照峰，計(jì)算其他各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果單峰面積占總峰面積10%以上指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD分別小于1.53%和1.48%(n=8)，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取1號(hào)供試品5份，依供試品溶液制備溶液，分別進(jìn)樣，以15號(hào)峰為參照峰計(jì)算。結(jié)果單峰面積占總峰面積10%以上指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD分別小于0.86%和 3.00%(n=5)。

加樣回收試驗(yàn):準(zhǔn)確稱取1號(hào)供試品0.5 g，平行6份，于每份樣品準(zhǔn)確加入已知質(zhì)量濃度的天麻素對(duì)照品溶液1.5 mL，加入15 mL

30%甲醇，按供試品溶液制備方法處理，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均加樣加收率為102.66%，RSD小于2.5%(n=6)。

2.2 對(duì)照指紋圖譜的建立

分別將各批樣品和天麻對(duì)照藥材上樣分析，記錄各自色譜，見圖1。根據(jù)10批天麻樣品和天麻對(duì)照藥材保留時(shí)間的一致性，確定16個(gè)共有峰，共中5號(hào)峰為天麻素。但由于天麻素對(duì)照品成分峰過早出現(xiàn)，故另選出峰時(shí)間穩(wěn)定、峰面積較大且分離度良好的15號(hào)峰為參照峰(S)，以其保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算其他各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。以天麻素為對(duì)照品，對(duì)照藥材作為“指紋對(duì)照品”[2]，建立天麻藥材的HPLC指紋圖譜(圖1)。可見，10批不同天麻樣品都能檢出16個(gè)指紋峰，但相對(duì)峰面積有所不同，表明不同產(chǎn)地天麻化學(xué)成分種類相似，但各成分的相對(duì)含量與絕對(duì)含量略有不同。

圖1 天麻藥材的高效液相色譜指紋圖譜

2.3 共有指紋峰分析

根據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》[3]和常用中藥材HPLC指紋圖譜測定技術(shù)[4]，單峰峰面積占指紋圖譜色譜總面積10%以上的共有指紋峰尚需標(biāo)定其與參照峰峰面積比值。10批天麻樣品16個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積(計(jì)算平均值)見表 2?？梢?，其中峰 1、峰 3、峰 5、峰 6、峰 8、峰 9、峰 11、峰 12 共 8 個(gè)指紋峰的峰面積均超過峰15(參照峰)的10%以上，可作為天麻定性鑒別、定量檢測的依據(jù)。相似度是評(píng)價(jià)有效成分間相對(duì)含量一致性的重要指標(biāo)。以相關(guān)系數(shù)為主、夾角余弦為輔進(jìn)行相似度分析，以16個(gè)共有指紋峰的相對(duì)峰面積為基本參數(shù)，對(duì)10批天麻樣品的HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果見表3。可見，TM2，TM5，TM7，TM10與TM對(duì)照的相關(guān)系數(shù)均在0.9以上，其相應(yīng)夾角余弦系數(shù)也均在0.8以上，說明高黎貢山(野生)、麗江巨甸、安徽大別山和陜西略陽九中金的天麻中各成分的相對(duì)含量與對(duì)照藥材較接近;而TM8(四川野生)的相關(guān)系數(shù)低于0.6，夾角余弦系數(shù)則低于0.4，其他樣品的相關(guān)系數(shù)及夾角余弦系數(shù)則界于中間數(shù)值，差別較大，可能與樣品產(chǎn)地、生長年限、采收時(shí)間等因素有關(guān);四川野生天麻的相似度不如四川家種天麻。以上說明，選用的天麻對(duì)照藥材與四川野生天麻的種屬差異較遠(yuǎn)，而安徽大別山和陜西略陰九中金(家種)產(chǎn)天麻則與天麻對(duì)照藥材種屬親近。

2.4 主要成分定量分析

對(duì)10批樣品中天麻素含量依本法進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表3。可見，安徽大別山產(chǎn)天麻中的天麻素含量最高，其次是四川家種天麻，高黎貢山(野生)、麗江巨甸、安徽亳州及陜西略陽九中金產(chǎn)天麻中的天麻素含量都超過對(duì)照藥材，且西藏林芝、云南小草壩和云南九華公司產(chǎn)天麻中的天麻素含量均高于中國藥典規(guī)定的0.20%，只有四川野生天麻中天麻素的含量低于0.20%。以上結(jié)果表明，現(xiàn)代指紋(fingerprint)分析是分析、比較、評(píng)價(jià)和校驗(yàn)[5]中藥材的一種手段。這里的指紋圖譜是指狹義的表達(dá)植物藥代謝產(chǎn)物化學(xué)特征，即中藥化學(xué)(成分)的指紋圖譜[6]。

表2 10批樣品16個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積(平均值)

表3 10批樣品共有指紋峰相對(duì)峰面積指紋圖譜的相似度分析及含量測定結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)初步建立了國內(nèi)不同產(chǎn)地的天麻藥材HPLC指紋圖譜，對(duì)10批藥材進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià);初步建立了天麻中天麻素類成分的共有模式，確定了16個(gè)共有峰為特征峰。該方法可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好、圖譜相對(duì)穩(wěn)定，可供天麻藥材內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)制訂時(shí)參考[7]。

采用兩相梯度洗脫裝置，分別將水相(純水1%醋酸、0.1%磷酸)和有機(jī)相(甲醇、乙腈)按不同配比進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果以甲醇－1%醋酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)分離效果最佳。取天麻素對(duì)照品溶液，以二極管陣列檢測器進(jìn)行全波長檢測，結(jié)果在226 nm及270 nm波長處均有吸收。但以甲醇－1%醋酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，以226 nm為檢測波長時(shí)天麻素的吸收峰飄移不定，故選擇270 nm為檢測波長。還對(duì)提取溶劑(甲醇、乙醇及不同比例的乙醇和水)、提取方法(超聲、回流)、提取時(shí)間等進(jìn)行了考察，確定了2.1.2項(xiàng)下供試品溶液的提取制備方法。

現(xiàn)階段，中藥的有效成分大多尚未明確，中藥指紋圖譜的整體性和模糊性正好符合中藥質(zhì)量控制的整體性要求，較單一成分或指標(biāo)成分的質(zhì)量控制方法更科學(xué)、合理[8]。但在中藥指紋圖譜中，可能還含有很多未知化合物的信息，該對(duì)它們作如何處理，仍是一個(gè)尚待研究的問題。

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HPLC Fingerprint of Gastrodia elata Blume

Huang Xiaoling1，Yang Chunyan1，Yuan Huiwen2

(1.Shenzhen Chronic Disease Prevention and Cure Centre，Shenzhen，Guangdong，China518020;2
.Shenzhen Institute for Drug Control，Shenzhen，Guangdong，China518029)

ObjectiveTo study the HPLC fingerprint of medicinal materialGastrodia elataBlume to provide the reliable method for its quality control.Methods The analysis was performed on Ultimate XB － C18column(250 mm × 4.6 mm，5 μm)with the mobile phase of methanal－1%glacial acetic acid aqueous solution in the gradient elution.The column temperature was 30 ℃ and the flow rate was 1.0 mL/min.The UV detector was set at 270 nm.Results The HPLC fingerprint ofGastrodia elataBlume was preliminarily established and 16 common peaks were displayed in the fingerprint.The average sample recovery rate of gastrodine was 102.66% ，RSD＜ 2.5%(n=6).Conclusion The HPLC fingerprint may provide a new model for controlling the quality of medicinal materialGastrodia elataBlume and also may provide an accurate and rapid tool for identifying unknown sample ofGastrodia elataBlume.

Gastrodia elataBlume;HPLC;fingerprint;quality control;gastrodine

R284.1;R282.71

A

1006－4931(2011)02－0017－03

2010－09－09)