丁 森,聶福平,王 昱,肖進(jìn)文,周雪梅,肖 雯,黃 鶴,劉生峰,周 慶,李應(yīng)國,蔡家利

痘病毒科(Poxiridae)羊痘病毒屬(Capripoxvirus,CPV)主要包括山羊痘病毒(Goatpox Virus,GTPV)、綿羊痘病毒(Sheeppox Virus,SPPV)和疙瘩皮膚病病毒(Lumpy Skin Disease Virus,LSDV)三種[1-5]。山羊痘、綿羊痘病毒引起的羊痘(Capripox)又名羊“天花”,是羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病,包括綿羊痘(Sheeppox,SP)和山羊痘(Goatpox,GP)。主要表現(xiàn)為發(fā)熱,無毛或少毛部位的皮膚或黏膜發(fā)生紅斑、丘疹、皰疹、水泡(少數(shù))、內(nèi)臟病變(特別是肺)[6]。疙瘩皮膚病病毒引起疙瘩皮膚病(Lumpy skin disease,LSD)是以患牛發(fā)熱,皮膚、黏膜、器官表面廣泛性結(jié)節(jié),淋巴結(jié)腫大,皮膚水腫為特征的傳染病。該病又稱結(jié)節(jié)性皮炎或塊狀皮膚病,能引起感染動(dòng)物消瘦,產(chǎn)乳量大幅度降低,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡。

GTPV和SPPV基因組約有150 kb,共有147個(gè)開放閱讀框(Open reading frame,ORF)。2001年美國科學(xué)家報(bào)道了LSDV的基因組序列,其基因組長145 kb～152 kb[7],基因組中沒有發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu),核苷酸組成中含有73%A+T,呈有規(guī)律的均勻分布。但是,三種病毒基因間的同源性非常高,如要對三種病毒進(jìn)行基因水平的檢測,必須找到針對三種病毒的特異性基因序列。通過全基因比對,發(fā)現(xiàn)三者的ORF132基因具有較好的特異性。因此對其進(jìn)行克隆分析,以期對后續(xù)研究有所幫助。

1 實(shí)驗(yàn)材料

山羊痘病毒株;綿羊痘病毒株;疙瘩皮膚病疫苗株;疙瘩皮膚病野毒株DNA;山羊睪丸原代細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室自行制備;MEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司;鏈-青霉素雙抗、胎牛血清購自 Thermo公司;DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司;膠回收試劑盒,載體連接試劑盒購自大連寶生物公司;JM109感受態(tài)細(xì)胞由重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室提供。引物由寶生物(大連)公司合成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 病毒培養(yǎng)和核酸提取 15天左右的雄性羊只,綁定,處死。無菌操作下,止血鉗夾住精索,剝離睪丸,去掉外層的膜,游離的睪丸,含10×雙抗 PBS清洗睪丸,鑷子撕去掉白色的薄膜,盡量干凈,把睪丸置于小燒杯中,眼科剪刀剪碎20 min;加無血清培養(yǎng)液DMEM(10×雙抗),用20mL針頭注射器反復(fù)吹打20次,用200或300目不銹鋼濾網(wǎng)過濾,沉淀一下,吸取上層的細(xì)胞;剩下的再吹打,過濾,吸取上層的細(xì)胞,清洗2次,3 000r/min,5min;分裝,加含雙抗(2×),10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基15 mL～20 mL;2～3 d后換液。待細(xì)胞長成單層后,準(zhǔn)備接毒。棄去細(xì)胞瓶內(nèi)原有培養(yǎng)液,無血清DMEM清洗1次;50μL種毒加450μL維持液(含2%胎牛血清,1%雙抗的MEM)混勻后加入到細(xì)胞瓶中;搖晃均勻,37℃吸附1h,期間每20min搖晃一次;1h后補(bǔ)充4.5mL維持液;37℃CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),觀察侵染結(jié)果。山羊痘、綿羊痘、疙瘩皮膚病病毒、陰性對照各一瓶;病變達(dá)75%以上時(shí),收毒。取出細(xì)胞瓶,封口,置-70℃冰箱凍實(shí)后,取出室溫融化,反復(fù)3次,使細(xì)胞釋放病毒。取山羊痘、綿羊痘和疙瘩皮膚病病毒細(xì)胞培養(yǎng)液各200μL,提取DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,10g/L瓊脂糖凝膠電泳。

2.2 基因的克隆和測序 山羊痘病毒ORF132基因 上 游 引 物 ,5′-ACAAACACTTCCCTCCTTAAGCTACT-3′,擴(kuò)增位置 ,4bp-465bp;綿羊痘病毒ORF132基因上游引物,5′-GACGAACATTTTTCCCTCTAAGCTAC-3′,擴(kuò)增位置 ,4bp-494bp;疙瘩皮膚病病毒 ORF132基因上游引物,5′-A TGACAAA YACTTCCCTCCTTTTAAGC-3′,擴(kuò) 增 位置 ,4bp-498bp;通 用 下 游 引 物 ,5′-ATCTCCATGNGAAACTTTACAAA-3′。PCR體系:10×PCR Buffer 2.5μL,2.5 each mmol/L dN TP Mix 1μL;25 mmol/LMgCl22μL,Taq 聚 合 酶 (5U/μL)0.4μL,上 游 引 物 (10μmol/L)1μL,下 游 引 物(10μmol/L)1μL,DNA 模版 5μL,補(bǔ)充滅菌蒸餾水至25μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 5min,95℃變性40s,50℃退火1min,72℃延伸 1min,進(jìn)行 35個(gè)循環(huán);72℃補(bǔ)充延伸8min。將 GTPV、SPPV及LSDV的PCR產(chǎn)物連接于19-T載體并轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細(xì)胞,選取PCR鑒定陽性的克隆質(zhì)粒各兩個(gè),送至大連寶生物公司進(jìn)行測序。

2.3 序列分析 利用相應(yīng)軟件對測序基因進(jìn)行同源性分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 接種三種病毒后山羊睪丸細(xì)胞病變圖 細(xì)胞貼壁的過程中,細(xì)胞形態(tài)有圓形逐漸變?yōu)椴灰?guī)則的多邊形,長梭型,呈纖維狀存在。接種病毒3天后細(xì)胞病變明顯:與對照組比較后發(fā)現(xiàn),山羊痘病毒可使山羊睪丸細(xì)胞產(chǎn)生皺縮,綿羊痘病毒可使細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀聚集和死亡漂浮,疙瘩皮膚病病毒主要使細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀聚集。(圖1,2,3)

3.2 陽性質(zhì)粒PCR鑒定電泳圖(圖4)。

3.3 同源性分析

3.3.1 四種病毒基因比對(圖5)。

3.3.2 基因網(wǎng)上比對 測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對后發(fā)現(xiàn)該山羊痘病毒與山羊痘病毒G20-L KV株、Pellor株有95%的相似性;綿羊痘病毒與綿羊痘病毒A株、NISKHI株有98%的相似性與10700-99 strain TU-V02127株有 97%的相似性;疙瘩皮膚病疫苗株與isolate Neethling vaccine LW 1959株有 99%的相似性,與 NI-2490 isolate Neethling2490株、NW-LW isolateNeethling Warmbaths LW株有97%相似性;疙瘩皮膚病野毒株與NI-2490 isolate Neethling 2490株、NW-LW isolate Neethling Warmbaths LW株有99%相似性,與isolate Neethling vaccine LW 1959株有96%的相似性(圖6)。

4 討 論

羊痘是所有動(dòng)物痘病中最為嚴(yán)重的一種,發(fā)病后成羊死亡率40%,羔羊死亡率100%,有本病的國家和地區(qū)的易感動(dòng)物及其相關(guān)產(chǎn)品被世界各國列為嚴(yán)格限制進(jìn)出的對象,嚴(yán)重影響國際貿(mào)易和養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展[8-10]。中國[11-12]、瑞典、印度[13]依據(jù)流行病學(xué)和臨床癥狀都有人類感染羊痘病毒的報(bào)道,因此,研究該病在公共衛(wèi)生方面有重要意義。羊痘病毒(SGPV)還可作為生物武器,成為世界恐怖分子威脅世界和平的有力手段,被劃歸到Ⅱ類危險(xiǎn)戰(zhàn)劑。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將該病定為法定通報(bào)疾病,我國將其列為Ⅰ類動(dòng)物疫病[10,14]。疙瘩皮膚病起源于非洲,并于1989年和2006年在以色列發(fā)生,顯示該病已逃逸出非洲大陸,有不斷蔓延的趨勢[1]。各種牛均易感,死亡率能達(dá)到3%～85%,給經(jīng)濟(jì)帶來較大的損失。

但是,目前世界各國都還未有較為可靠的檢測該屬病毒的方法,使進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫處于被動(dòng)地位。為嚴(yán)格防止該類病的傳入,盡早檢出,減少損失,建立快速高效,操作簡便,成本低廉的 GTPV、SPPV及LSDV檢測方法迫在眉睫。

基于此,對 GenBank上公布的山羊痘、綿羊痘及疙瘩皮膚病各個(gè)開放閱讀框的基因序列,進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn),ORF132基因相對于其他開放閱讀框有較大的特異性,可作為目的基因建立分子生物學(xué)檢測方法?？梢源藶樘卣餍蛄性O(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定以及設(shè)計(jì)探針進(jìn)行基因芯片檢測該屬病毒。建立一整套該屬病毒的分子診斷技術(shù)平臺(tái),對滿足進(jìn)出境動(dòng)物檢疫工作的需要,控制羊痘傳播,并防止牛疙瘩皮膚病由境外向我國擴(kuò)散,保障我國的畜牧業(yè)健康、安全發(fā)展具有十分重要的意義。

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