栗永茂,曹勝波,陳 龍,霍雨艷,熊 濤,吳光旭

乙型腦炎(Japanese encephalitis,J E,簡(jiǎn)稱乙腦)是一種由蚊媒傳播的人獸共患傳染病,病死率高,后遺癥嚴(yán)重,主要流行于東南亞各國(guó)。其病原體乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,J EV)是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒,基因組全長(zhǎng)約11kb,含單一的開放閱讀框,依次編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(C、PrM 和 E)和 7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5)。其中非結(jié)構(gòu)蛋白NS5是乙型腦炎病毒中最大最保守的蛋白,約 103kD,具有甲基轉(zhuǎn)移酶和 RNA依賴的RNA聚合酶活性,在病毒復(fù)制中發(fā)揮重要作用,但其更多的生物學(xué)功能尚不清楚。本研究通過構(gòu)建NS5的原核表達(dá)載體和與 EGFP融合的真核表達(dá)載體,探討該蛋白在BHK-21細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位,為進(jìn)一步研究NS5蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞與主要試劑 質(zhì)粒 PHR-WNVPRME含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因,為本室保存。真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)、原核表達(dá)載體pET-28a(+)和BH K-21細(xì)胞均為本室保存。大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipfectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司。His標(biāo)簽鼠源單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司。

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,武漢 430070辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠 IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 病毒RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 乙腦病毒P3株感染BH K-21細(xì)胞,37℃、5%CO2培養(yǎng)3d后收集培養(yǎng)液。取0.25mL病毒培養(yǎng)液用 Trizol試劑(Gibco,Brl.)提取總 RNA,按照 ReverTra Ace-α-試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 NS5原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計(jì)擴(kuò)增NS5全長(zhǎng)基因引物,以cDNA為模板,擴(kuò)出全長(zhǎng)基因。引物上下游分別設(shè)計(jì)B amHⅠ和X hoⅠ的酶切位點(diǎn),且上游引物加入起始密碼子,下游引物加入終止密碼子。引物為:

PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃5min變性后進(jìn)入循環(huán),循環(huán)參數(shù)為:95℃45s,55℃45s,72℃3min,35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后,B amHⅠ和X hoⅠ雙酶切,插入用同樣酶切的原核表達(dá)載體pET-28a(+)中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落,小量提取質(zhì)粒,雙酶切及測(cè)序鑒定,重組原核表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-NS5。

1.4 NS5蛋白的原核表達(dá)及鑒定 將構(gòu)建正確的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-NS5及對(duì)照載體pET-28a(+)分別轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3),挑取單克隆接種于2mL含卡那霉素(50μg/mL)抗性的LB培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)過夜的新鮮菌液按1∶100的比例轉(zhuǎn)接,培養(yǎng)3h,至OD600為0.6～1,此時(shí)加 IPTG至終濃度1mmol/L。誘導(dǎo)表達(dá)4h后收集菌體并高壓裂解,將裂解上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,檢測(cè) His/NS5融合蛋白的表達(dá)量和分泌形式。

Western blot進(jìn)一步鑒定 His/NS5融合蛋白。重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離,半干法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上,使用含1%BSA的 TBST 4℃封閉過夜。以抗 His標(biāo)簽的鼠源單抗(1∶1 000)作為一抗,HRP標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG(1∶1000)作為二抗進(jìn)行孵育。最后,利用DAB顯色。鑒定正確后,按照同樣的方法大量制備NS5蛋白的裂解液,TE透析純化蛋白,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 NS5蛋白多克隆抗體的制備 用純化的NS5重組蛋白免疫4周齡BALB/c雌性小鼠,基礎(chǔ)免疫劑量為25μg/只,與等體積弗氏完全佐劑混合制成抗原,采用背部皮下多點(diǎn)注射,免疫間隔14d,共免疫4次。第4次免疫后,小鼠尾靜脈取血,分離血清,并用含空載體大腸桿菌裂解液1∶200預(yù)處理(4℃過夜)。用純化的NS5蛋白制備抗原,以不同稀釋度血清作為一抗,以 HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG作為二抗,采用ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)。多抗-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 構(gòu)建含 EGFP的真核表達(dá)質(zhì)粒 根據(jù) EGFP基因的序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增完整 EGFP基因片段的引物EGFP-P1和 EGFP-P2,上下游引物兩端分別設(shè)計(jì)X hoⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)。引物為:

EGFP的擴(kuò)增以質(zhì)粒 PHR-WNV-PRME為模板,反應(yīng)程序?yàn)?95℃5min變性后進(jìn)入循環(huán),循環(huán)參數(shù)為:95℃45S,55℃45S,72℃1min,35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收,X hoⅠ和XbaⅠ雙酶切,插入用同樣酶切的pcDNA3.1(+)中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落,小量提取質(zhì)粒,雙酶切鑒定,并通過測(cè)序和轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)一步鑒定,重組質(zhì)粒命名為pcD-EGFP。將鑒定正確的pcD-EGFP用 TIANGEN無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒大量制備轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒,并測(cè)定質(zhì)粒濃度,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 NS5與EGFP融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計(jì)擴(kuò)增NS5全長(zhǎng)基因引物,以cDNA為模板,擴(kuò)出全長(zhǎng)基因。引物上下游分別設(shè)計(jì)B amHⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn),且上游引物含有起始密碼子,下游引物不含終止密碼子。引物為:

PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃5min變性后進(jìn)入循環(huán),循環(huán)參數(shù)為:95℃45s,55℃45s,72℃3min,35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收,B amHⅠ和X hoⅠ雙酶切,插入用同樣酶切的pcD-EGFP中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落,小量提取質(zhì)粒,雙酶切及測(cè)序鑒定,重組的融合表達(dá)質(zhì)粒命名為pcD-EGFPNS5。將鑒定正確的pcD-EGFP-NS5用TIANGEN無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒大量制備轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒,并測(cè)定質(zhì)粒濃度,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 間接免疫熒光檢測(cè)NS5蛋白的真核表達(dá)BH K-21細(xì)胞接種 24孔板,待細(xì)胞長(zhǎng)至 70%～80%,取適量大提融合表達(dá)質(zhì)粒pcD-EGFP-NS5,按照Lipofectamine 2000試劑盒說(shuō)明轉(zhuǎn)染細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立空質(zhì)粒pcD-EGFP作為對(duì)照。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,NS5蛋白多抗作為一抗,羊抗鼠 FITC標(biāo)記的紅熒光抗體作為二抗,熒光顯微鏡下觀察。

1.9 NS5蛋白的亞細(xì)胞定位 BHK-21細(xì)胞接種35mm×12mm玻片平皿,待細(xì)胞長(zhǎng)至50%～60%,取適量大提融合表達(dá)質(zhì)粒pcD-EGFP-NS5,按照Lipofectamine 2000試劑盒說(shuō)明轉(zhuǎn)染細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立空質(zhì)粒 EPC轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染后48h,DAPI染細(xì)胞核,在激光共聚焦顯微鏡下觀察,確定表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞定位。

2 結(jié) 果

2.1 NS5蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 PCR擴(kuò)增NS5,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可觀察到約2.7kb的特異性條帶,與預(yù)計(jì)的DNA片段大小相符。重組質(zhì)粒pET-NS5經(jīng)B amHⅠ和XhoⅠ雙酶切,可見兩條帶,分別約為5.4kb和2.7kb,與預(yù)計(jì)大小相符,證實(shí)構(gòu)建正確(圖1)。上海生工測(cè)序結(jié)果與NCBI上公布的乙腦 P3株NS5蛋白序列有99%的同源性。

圖1 重組質(zhì)粒pET-NS5酶切鑒定M1:DL15000 marker;M2:DL5000 marker;3:BamHⅠ和 XhoⅠ雙酶切Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET-NS5 by restriction enzyme digestionM1:DL15000 marker;M2:DL5000 marker;3:digested byBamHⅠandXhoⅠ

2.2 含EGFP的真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 PCR擴(kuò)增EGFP基因,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可觀察到約0.75kb的特異性條帶,與預(yù)計(jì)的DNA片段大小相符。重組質(zhì)粒pcD-EGFP經(jīng)XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切,可見兩條帶,分別約為5.4kb和0.73kb,與預(yù)計(jì)大小相符,證實(shí)構(gòu)建正確(圖2)。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,24h后可見報(bào)告基因 EGFP表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)該質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖2 重組質(zhì)粒pcD-EGFP酶切鑒定M1:DL15000 marker;M2:DL5000 marker;3:重組質(zhì)粒pcD-EGFPXhoⅠ和 XbaⅠ雙酶切Fig.2 Identification of recombinant plasmid pcD-EGFP by restriction enzyme digestionM1:DL15000 marker;M2:DL5000 marker;3:Digested byXhoⅠandXbaⅠ

2.3 NS5蛋白與EGFP的融合表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 PCR擴(kuò)增NS5(無(wú)終止密碼子),產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可觀察到約2.7kb的特異性條帶,與預(yù)計(jì)的DNA片段大小相符。融合表達(dá)質(zhì)粒pcD-EGFP-NS5經(jīng)B amHⅠ和XhoⅠ雙酶切,可見兩條帶,分別約為6.1kb和2.7kb,與預(yù)計(jì)大小相符,證實(shí)構(gòu)建正確(圖3)。上海生工測(cè)序結(jié)果與NCBI上公布的乙腦 P3株NS5蛋白序列同源性達(dá)99%的,且NS5與EGFP融合的讀碼框完全正確。

圖3 重組質(zhì)粒pcD-EGFP-NS5酶切鑒定1:重組質(zhì)粒pcD-EGFP-NS5BamHⅠ和 XhoⅠ雙酶切M1:DL15000 marker;M2:DL5000 markerFig.3 Identification of recombinant plasmid pcD-EGFP-NS5 by restriction enzyme digestion1:Digested byBamHⅠandXhoⅠ;M1:DL15000 marker;M2:DL5000 marker

2.4 NS5原核表達(dá)蛋白鑒定 對(duì)原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果顯示重組表達(dá)的 His/NS5融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為103kD,與預(yù)期大小一致,主要以包涵體形式表達(dá)(圖4)。為進(jìn)一步對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定,使用 His單抗進(jìn)行Western blot分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白能夠?yàn)?His單抗特異識(shí)別(圖5),進(jìn)一步證明了重組NS5蛋白已獲得正確表達(dá)。

圖4 重組 NS5蛋白的SDS-PAGE分析M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:IPTG誘導(dǎo)的重組菌pET-NS5破菌上清;2:IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌pET-28a(+)破菌上清;3:IPTG誘導(dǎo)的重組菌pET-NS5破菌沉淀;4:IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌pET-28a(+)破菌沉淀Fig.4 Analysis of recombinant NS5 protein by SDS-PAGEM:Protein molecular weight marker;1:Supernatent of pET-NS5 induced with IPTG;2:Supernatent of pET-28a(+)induced with IPTG;3:Sediment of pET-NS5 induced with IPTG;4:Sediment of pET-28a(+)induced with IPTG

2.5 NS5多克隆抗體的制備 第4次加強(qiáng)免疫后,采集小鼠血清,ELISA檢測(cè)血清中特異抗體的效價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),所得血清效價(jià)可達(dá)到1∶12 800,表明NS5重組蛋白免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗NS5的特異抗體。

圖5 重組 NS5蛋白Western blot分析1:誘導(dǎo)的細(xì)菌pET-28a(+)破菌沉淀;2:誘導(dǎo)的重組菌pET-NS5破菌沉淀;M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Fig.5 Analysis of recombinant NS5 protein by Western blot1:Sediment of pET-28a(+)induced;2:Sediment of pET-NS5 induced; M: Protein molecular weight marker

2.6 間接免疫熒光檢測(cè)NS5蛋白的真核表達(dá) 轉(zhuǎn)染pcD-EGFP-NS5的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè),結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染融合表達(dá)質(zhì)粒pcD-EGFP-NS5的細(xì)胞中可見到特異的紅色熒光;而空載體pcD-EGFP轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞中無(wú)紅色熒光(圖6),表明NS5蛋白在BHK-21細(xì)胞中獲得了表達(dá)。2.7 NS5蛋白的亞細(xì)胞定位 融合表達(dá)質(zhì)粒pcDEGFP-NS5轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,DAPI染核后,在激光共聚焦顯微鏡下拍照(圖6),結(jié)果顯示:空載體pcD-EGFP表達(dá)的綠色熒光蛋白均勻分布于整個(gè)細(xì)胞中,且綠色較亮;NS5蛋白則呈顆粒狀不均勻分布于整個(gè)細(xì)胞中,且顆粒狀大多分布在細(xì)胞質(zhì)中。

圖6 轉(zhuǎn)染pcD-EGFP-NS5細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的間接免疫熒光及亞細(xì)胞定位觀察(400×)A、B、C、D:轉(zhuǎn)染pcD-EGFP-NS5 的細(xì)胞 ,依次為綠色熒光、間接免疫熒光、DAPI染核、ABC 疊加;E、F、G、H:轉(zhuǎn)染 pcDEGFP的對(duì)照細(xì)胞,依次為綠色熒光、間接免疫熒光、DAPI染核、EFG疊加Fig.6 IFA and subcellular localization of pcD-EGFP-NS5 in transfected cells and control cells(400×)A,B,C and D:The cells were transfected with pcD-EGFP-NS5,followed by green fluorescence,IFA,DAPI stained nuclears,the merged image of A,B and C;E,F,G and H:The cells were transfected with pcD-EGFP,followed by green fluorescence,IFA,DAPI stained nuclears,the merged image of E,F and G

3 討 論

乙腦NS5蛋白在黃病毒中其氨基酸序列同源性最高,是最大的保守蛋白。Rice等在1985年提出了NS5蛋白可能參與病毒RNA聚合酶的組成。有學(xué)者指出,乙腦NS5蛋白的表達(dá)能阻斷IFN介導(dǎo)的Jak-Stat信號(hào)通路,比如 Stat1核轉(zhuǎn)移、Tyk2和Stat1的酪氨酸磷酸化[3-4]。也有研究指出,四種以乙腦NS5基因?yàn)榘谢虻男“l(fā)夾RNA(shRNA)表達(dá)載體能顯著抑制乙腦病毒的轉(zhuǎn)錄[5]。目前對(duì)NS5蛋白的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

制備一種特異性好、效價(jià)高的抗體,是研究相關(guān)基因生物學(xué)功能非常重要的一步。我們通過原核表達(dá)獲得了NS5蛋白,并免疫小鼠,制備了NS5多克隆抗體。pET-28a(+)載體原核表達(dá)系統(tǒng),為 His與目的基因融合表達(dá),因此在鑒定NS5蛋白表達(dá)時(shí),我們采用了抗 His的單克隆抗體。為了獲得較高效價(jià)的NS5蛋白多克隆抗體,我們對(duì)小鼠免疫4次,并獲得了效價(jià)為1∶12 800的特異性好、效價(jià)較高的多抗,為下面的實(shí)驗(yàn)奠定了良好基礎(chǔ)。

另外,我們構(gòu)建了EGFP/NS5融合表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染到BHK-21細(xì)胞中表達(dá),試圖用 EGFP作為分子標(biāo)簽來(lái)確定NS5在細(xì)胞中的定位信息,為進(jìn)一步研究NS5蛋白提供依據(jù)。將 EGFP/NS5融合基因轉(zhuǎn)染到BHK-21細(xì)胞中時(shí)發(fā)現(xiàn),較多的細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比,有變圓的趨勢(shì),且細(xì)胞狀態(tài)也較差。有報(bào)道稱,乙腦的NS2B-NS3的融合蛋白,能誘導(dǎo)人類髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡[6],而NS5蛋白能否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及該現(xiàn)象是否由NS5誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而引發(fā)的,還需要進(jìn)一步的研究。同時(shí),NS5蛋白不均勻分布于整個(gè)細(xì)胞,并主要點(diǎn)狀聚集在細(xì)胞質(zhì)中,而對(duì)照細(xì)胞中綠色熒光均勻分布于整個(gè)細(xì)胞,且較亮。這些數(shù)據(jù)都將為乙腦NS5蛋白的生物學(xué)功能研究提供依據(jù)。

[1]Bartholomeusz A,Tomlinson E,Wright PJ,et al.Use of a flavivirus RNA-dependent RNA polymerase assay to investigate the antiviral activity of selected compounds[J].Antiviral Res,1994,24(4):341-350.

[2]Koonin EV.Computer-assisted identification of a putative methyltransferase domain in NS5 protein of flaviviruses and lambda 2 protein of reovirus[J].J Gen Virol,1993,74(Pt4):733-740.

[3]Lin R J,Chang B L,Yu H P,et al.Blocking of interferon-induced jak-statsignaling by Japanese encephalitis virus NS5 through a protein tyrosine phosphatase-mediated mechanism[J].Journal of Virology,2006,80(12):5908-5918.

[4]趙慧,鄧永強(qiáng),陳水平,等.日本腦炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5對(duì)IFN-α介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2008,33(7):811-815.

[5]Qi W B,Hua R H,Yan L P,et al.Effective inhibition of Japanese encephalitis virus replication by small interfering RNAs targeting the NS5 gene[J].Virus Res,2008,132(1-2):145-151.

[6]Yang T C,Shiu S L,Chuang P H,et al.Japanese encephalitis virus NS2B-NS3 protease induces caspase 3 activation and mitochondria-mediated apoptosis in human medulloblastoma cells[J].Virus Research,2009,143:77-85.