李世軍,張翠彩,李秀文,唐光鵬,田克成,劉 英,蔡星和,于 春,聶一新,蔣秀高

貴州省3株鉤端螺旋體分離株P(guān)FGE分型與基因種鑒定＊

李世軍1,張翠彩2,李秀文2,唐光鵬1,田克成1,劉 英1,蔡星和1,于 春1,聶一新2,蔣秀高2

目的 應(yīng)用脈沖場(chǎng)電泳(PFGE)分型技術(shù)和16S rRNA基因測(cè)序分析技術(shù)分別對(duì)貴州省3株動(dòng)物宿主鉤端螺旋體分離菌株進(jìn)行分子分型和基因種鑒定,了解貴州省鉤端螺旋體的分子流行病學(xué)特征。方法應(yīng)用DNA限制性內(nèi)切酶No t I對(duì)鉤端螺旋體染色體DNA酶切后,用PFGE將DNA片段分離,采用BionumericsV 4.0將3株鉤體菌株 PFGE圖譜與中國(guó)15群15型參考菌株進(jìn)行聚類分析;同時(shí),應(yīng)用PCR擴(kuò)增幾乎全長(zhǎng)的鉤體16S rRNA基因片段,并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向序列測(cè)定,并與 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已注冊(cè)的核酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)、確定基因種、分析親緣進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果來(lái)自貴州省的3株動(dòng)物宿主分離鉤體菌株P(guān)FGE帶型命名為L(zhǎng)epNo t I 002和LepNo t I 003,經(jīng)聚類分析,3株菌株與黃疸出血群黃疸出血型賴株的相似性大于95%。16S rRNA基因測(cè)序和分析表明,3株貴州分離鉤體菌株之間的同源性為100%,與致病性鉤體問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體種(L.interrogans)不同血清型參考菌株的同源性達(dá)100%。結(jié)論3株貴州動(dòng)物分離鉤體菌株經(jīng) PFGE分型鑒定與黃疸出血群賴型賴株的相似性大于95%,經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序分析鑒定為L(zhǎng).interrogans種,上述兩種方法對(duì)貴州省鉤體分離菌株的鑒定結(jié)果一致,有助于貴州省鉤端螺旋體病的主動(dòng)監(jiān)測(cè)、暴發(fā)調(diào)查和傳染源追蹤。

鉤端螺旋體;PFGE;16S rRNA;序列分析;同源性;基因種

鉤端螺旋體病是一種流行范圍十分廣泛的自然疫源性疾病,其病原鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)菌型復(fù)雜,抗原性各異[1-2]。傳統(tǒng)的顯微凝集試驗(yàn)(microscopic agglutination test,M A T)和交叉凝集吸收試驗(yàn)(cross-agglutinin absorp tion test,CAA T)常用來(lái)鑒定鉤體分離菌株,而上述傳統(tǒng)鑒定方法局限于對(duì)菌株表型進(jìn)行分析、耗時(shí)耗力、且需要收集200多株參考菌株和制備相應(yīng)的免疫血清[2]。隨著研究的不斷深入,各種分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行分子分型已得到了廣泛的應(yīng)用。PFGE分型技術(shù)具有重復(fù)性好、分辨力強(qiáng)、易標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn),在發(fā)現(xiàn)傳染源和預(yù)防控制疾病傳播方面發(fā)揮了重要作用,已有不少學(xué)者將PFGE分型技術(shù)應(yīng)用于鉤端螺旋體的分型,并取得與傳統(tǒng)方法一致的分型鑒定結(jié)果[3-7]。此外,細(xì)菌的 16S核糖體 RNA(ribosome RNA,rRNA)以其在進(jìn)化上的特征性序列,現(xiàn)已被廣泛用于細(xì)菌分類和鑒定的分子指標(biāo)。其具體操作是,以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增細(xì)菌樣本中的16S rRNA的基因片段,通過(guò)克隆、測(cè)序或酶切、探針雜交獲得其序列信息,再與16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較,確定其在進(jìn)化中的位置,從而鑒定樣本中可能存在的微生物種類[8-9]。Mo rey RE[10]等于2006年將16SrRNA基因測(cè)序分析技術(shù)應(yīng)用于鉤體基因種的鑒定并證明該方法用于鑒定鉤體分離菌株具有可行性。本研究應(yīng)用PFGE方法對(duì)貴州省動(dòng)物宿主分離的鉤體菌株進(jìn)行了PFGE分型研究,同時(shí),采用16S rRNA基因測(cè)序分析技術(shù)對(duì)3株分離菌株進(jìn)行了基因種的鑒定,為貴州省鉤體分子流行病學(xué)研究和鉤體病的預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源及培養(yǎng) 選擇本實(shí)驗(yàn)室2007-2009年分離保存的致病性鉤體3株,分離自貴州省榕江縣監(jiān)測(cè)點(diǎn)斯氏家鼠腎臟。采用 EMJH培養(yǎng)基培養(yǎng)[11],PFGE用分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參考株為全球通用的沙門菌Braenderup血清型 H9812株,由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心鉤體室提供。

1.2 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶 N ot I為大連寶生物工程公司(TaKaRa)產(chǎn)品,蛋白 K為德國(guó)Merck公司產(chǎn)品,瓊脂糖(SeaKem Gold)為美國(guó)BMA公司產(chǎn)品,溴化乙錠為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品,鉤體 EMJH培養(yǎng)基為美國(guó)BD公司產(chǎn)品,DNA Marker為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化方法提取和 Xba I酶酶切后的沙門菌 H9812株DNA產(chǎn)物,其它試劑均使用分析純?cè)噭?。PCR PreM ix 20(l反應(yīng)體系為北京賽百盛基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品;100 bp DNA Marker為天根生物工程公司產(chǎn)品;硅膠膜型TM基因組DNA提純?cè)噭┖袨楸本┵惏偈⒒蚣夹g(shù)有限公司產(chǎn)品;實(shí)驗(yàn)中所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 主要儀器 冷凍離心機(jī)為 KR 22i型(JOUAN,法國(guó)),比濁管為 REF352054 型(BD,美國(guó)),水浴搖床為OLS2000型(Grant,英國(guó)),細(xì)菌濁度儀為Densimat型(BioMérieux,法國(guó)),脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀為CHEF DR Ⅲsystem型(Bio-Rad,美國(guó)),凝膠成像系統(tǒng)為 Gel Doc 2000型(Bio-Rad,美國(guó))。PCR儀為SENS U EST梯度 PCR儀(德國(guó))。

1.4 PFGE分型分析方法 PFGE操作方法依據(jù)參考文獻(xiàn)[5]。

1.5 16S rRNA基因序列分析方法

1.5.1 鉤體DNA提取 采用DNA提取試劑盒。按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.5.2 引物合成 參照參考文獻(xiàn)[10]提供的引物序列,引物序列由大連寶生物公司合成,上、下游引物序 列 如 下:fD1:5’-CCGAA TTCGTCGACAACAGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3’; rP2:5’-CCCGGGA TCCAAGCTTACGGCTACCTTG TTACGACTT-3’。

1.5.3 PCR反應(yīng)體系 各 PCR反應(yīng)體積為50 μL,內(nèi)含 1ng/μL 的 DNA 模板 8μL、5μmol/L 引物各4μL、dN TP 4μL、TaKaRa TaqTMDNA 聚合酶1μL、10 ×buffer 5μL、H2O 24μL。

1.5.4 PCR反應(yīng)參數(shù) 94℃預(yù)變性 5 min;94℃15 s、50℃5 s、72℃90 s,共 35 個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。

1.5.5 PCR產(chǎn)物檢測(cè) 取5μL產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠85 V電泳30 min后凝膠成像系統(tǒng)拍照。1.5.6 DNA序列的測(cè)定與分析 將PCR產(chǎn)物委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序,測(cè)序序列文件的拼接、編輯使用Contig、DNAStar軟件;序列同源性比對(duì)在 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 鉤體菌株P(guān)FGE型 3株鉤體菌株經(jīng)限制性內(nèi)切酶 N ot l酶切及 PFGE后,產(chǎn)生不同條帶的PFGE帶型的圖譜,共分為2個(gè) PFGE型,其中 G30和 G31菌株的PFGE圖譜產(chǎn)生12條帶,屬于Lep-Not I 003型。G32菌株產(chǎn)生13條帶,屬LepNot I 002(見(jiàn)圖 1)。

2.2 鉤體菌株P(guān)FGE譜型聚類分析 以相似性>75%作為同類株的判斷標(biāo)準(zhǔn),3株鉤體菌株 PFGE帶型與PulseNet China數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)流行的15群15型鉤體參考菌株的PFGE圖譜進(jìn)行聚類分析,G30和G31菌株與中國(guó)主要流行的黃疸出血群賴型賴株(中國(guó)編號(hào)為56601)PFGE譜型相似性為100%,G32菌株與中國(guó)主要流行的黃疸出血群賴型賴株相似性約為95%(如圖2)。

2.3 鉤體菌株16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 經(jīng)PCR擴(kuò)增,3株鉤體分離菌株16SrRNA基因均擴(kuò)增出預(yù)期1 432 bp大小的片段,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 貴州省鉤體分離株P(guān)FGE圖Fig.1 PFGE maps of Leptospira strains isolated in Guizhou Province M:DNA Marker;1:G30(LepNot I.003);2:G31(LepNot I.003):3:G32(LepNot I.002)

圖2 貴州省鉤體分離菌株與問(wèn)號(hào)鉤體代表菌株聚類分析圖Fig.2 Dentrogram of PFGE profiles of isolated Leptospira strains from Guizhou Province and reference strains belonging to 15 serovar 15 serogroups of L.interrogans

圖3 貴州省鉤體分離菌株16S rRNA基因PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3 PCR detection resultsof 16S r RNA gene of Lep tospira strains isolated from Guizhou province M:DNA Marker;1:G30(LepNot I.003);2:G31(LepNot I.003);3:G32(LepNot I.002);4 Serovar-groups Icterohaemo rrhagiae Serovar Lai strain Lai(strain 56601)

2.4 鉤體菌株16S rRNA基因序列分析 3株鉤體分離菌株16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的鉤體16S rRNA基因序列比對(duì),結(jié)果3株鉤體16S rRNA基因的擴(kuò)增序列與致病性鉤端螺旋體分支下屬的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體種(Lep tospira interrogans)所包含血清型(如Lep tospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae,Leptospira interrogans serovar Australis,Lep tospira interrogans serovar Autum nalis,Leptospira interrogans serovar Bulgarica,Leptospira interrogans serovar Canicola,Lep tospira interrogans serovar,Leptospira interrogans serovar,Lep tospira interrogans serovar Copenhageni,Leptospira interrogans serovar Hardjo,Leptospira interrogans serovar Pomona,Lep tospira interrogans serovar Pyrogenes等)代表菌株的16S rRNA基因核苷酸序列同源性為100%,而與其它種如 Lep tospira alexanderi,Lep tospira borgpetersenii和Leptospira noguchii等基因種代表菌株16S rRNA核苷酸序列同源性為99%,根據(jù)Morey RE等[10]的研究結(jié)果判斷,上述3株鉤體分離菌株均屬L.interrogans種。

3 討 論

鉤體病是一種全世界廣泛流行的人畜共患的傳染病,至今我國(guó)已發(fā)現(xiàn)致病性鉤體有18個(gè)血清群76個(gè)血清型。鉤體常用的分類法為血清學(xué)分類法和基因分類法。血清學(xué)分類法是以O(shè)抗原為主要靶抗原的分類法,通過(guò)交叉凝集吸收試驗(yàn)將鉤體分成不同血清型。然而,交叉凝集吸收試驗(yàn)需要多種抗血清,操作繁瑣、耗時(shí)且難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和微生物基因組測(cè)序工作的進(jìn)展,近年國(guó)際上在細(xì)菌分類學(xué)中出現(xiàn)以基因序列為基礎(chǔ)的分型方法,PFGE圖譜分析和16S rRNA基因分析是較為常用的方法[7-8]。

Herrmann等[13]于1992年將 PFGE用于鉤體分型,結(jié)果顯示鉤體菌株P(guān)FGE圖譜分析與血清學(xué)分型結(jié)果具有一致性。蔣秀高等[14]于2001年采用PFGE法檢測(cè)了中國(guó)15群15型15株鉤體參考菌株,發(fā)現(xiàn)各參考菌株P(guān)FGE圖譜各具特征性。Galloway和Lever[4]于2008年用改進(jìn)的PFGE法檢測(cè)206株鉤體,也證明了鉤體菌株的 PFGE分類與血清學(xué)分類結(jié)果一致。

此外,不同血清群可顯示不同的PFGE帶型特點(diǎn),同一血清群鉤體 PFGE譜型相似性則明顯較高。辛?xí)苑嫉萚15]于2001年發(fā)現(xiàn),PFGE圖譜能有效分辨中國(guó)流感傷寒群不同血清型鉤體參考株。秦進(jìn)才等[16]證明傳統(tǒng)的血清學(xué)分類法與 PFGE法鑒定新血清型鉤體的結(jié)果完全一致。上述資料表明,PFGE用于鉤體分型有較高特異性,其分型結(jié)果不僅能與血清學(xué)分類相吻合,還可體現(xiàn)鉤體基因的多態(tài)性并有利于遺傳分類學(xué)鑒定。本研究中的3株貴州鉤體分離株經(jīng) PFGE分析分為L(zhǎng)epNot I 002和LepNot I 003 PFGE型,經(jīng)與國(guó)內(nèi)鉤體15群15型參考菌株聚類分析,LepNot I003 PFGE型(G30和G31株)與黃疸出血群賴型賴株(國(guó)內(nèi)編號(hào)56601)的相似性為100%,LepNot I002 PFGE型(G32株)與黃疸出血群賴型賴株(國(guó)內(nèi)編號(hào)56601)的相似性約為95%,以相似度大于75%的標(biāo)準(zhǔn)[7]判定,G30、G31和G32 3株分離菌株同屬黃疸出血群賴型。此次檢測(cè)中,雖檢測(cè)樣本有限,且按75%的相似度判定同為黃疸出血群賴型,但3株菌株由于條帶差異卻屬于兩個(gè)不同的PFGE型,這體現(xiàn)了PFGE具有高分辨率的特點(diǎn)。

貴州省黔東南地區(qū)是鉤體病的老疫源地,該地區(qū)每年均有數(shù)例鉤體病例發(fā)生,本研究中的鉤體菌株分離自該地區(qū)榕江縣監(jiān)測(cè)點(diǎn)的鼠腎,我們參考張艷,蔣秀高等建立的鉤體PFGE實(shí)驗(yàn)程序?qū)λ蛛x3株鉤體菌株進(jìn)行PFGE分型鑒定,PFGE圖譜與我國(guó)15群15型參考菌株的聚類分析結(jié)果表明3株分離株與黃疸出血群賴型賴株的相似性最高(>95%),提示鉤體黃疸出血群賴型可能是該地區(qū)的流行菌型。

傳統(tǒng)的血清學(xué)分類方法將鉤端螺旋體分為致病性的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體(L.interrogans)和雙曲鉤端螺旋體(L.bif lexa)[1-2]。16S rRNA為原核生物核糖體中的一種核糖體RNA,以該基因?yàn)榛A(chǔ)建立的分子分類方法目前已被國(guó)際學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)可,而以基于該基因的DNA-DNA雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的分類方法將鉤端螺旋體屬分為17個(gè)基因種[17-18],其中的某些基因種包括致病與非致病的血清型,這與傳統(tǒng)的血清學(xué)分類方法有所不同。Morey RE等采用16S rRNA全長(zhǎng)基因測(cè)序技術(shù)結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化分析鑒別涵蓋17個(gè)種的鉤端螺旋體菌株,將鉤端螺旋體分為致病性、非致病性和未知致病性的3大分支(即pathogenic,nonpathogenic,intermediate clade),其中致病性的包括8個(gè)種,非致病性的包括6個(gè)種,未知致病性的包括3個(gè)種。根據(jù)Morey RE的研究結(jié)果,同一種內(nèi)不同血清型菌株之間16S rRNA基因序列的平均差別堿基對(duì)數(shù)目?jī)H為0.2對(duì)(測(cè)序長(zhǎng)度約為1 430個(gè)堿基),同一分支內(nèi)不同種的鉤體菌株16S rRNA基因序列的差別堿基對(duì)數(shù)目為幾個(gè)至十幾個(gè),來(lái)自不同分支內(nèi)的種間差別堿基對(duì)數(shù)目為幾十至幾百之間[10]。本研究的 G30,G31和 G32菌株16S rRNA基因序列的測(cè)序長(zhǎng)度分別為1413,1360,1349,3株菌株16S rRNA基因序列的同源性為100%,根據(jù)Mo rey RE的結(jié)果,與致病性鉤體分支內(nèi)L.interrogans種內(nèi)的不同血清型代表菌株16S rRNA基因序列的同源性為100%,而與該分支內(nèi)的其他種的同源性為99%,即與該分支內(nèi)的其它種的差別堿基對(duì)數(shù)目相差為1%(G30,G31和 G32菌株的差別堿基數(shù)分別為14.13,13.60,13.49個(gè)),上述資料提示,本研究中3株鉤體分離菌株屬于L.interrogans種。

本研究從分子生物學(xué)角度對(duì)貴州省鉤體分離菌株進(jìn)行PFGE分型,結(jié)果顯示所分離的3株鉤體菌株屬于黃疸出血群賴型賴株?；?6S rRNA基因測(cè)序技術(shù)的分析對(duì)分離菌株進(jìn)行種的鑒定結(jié)果顯示為致病性鉤體分支的問(wèn)號(hào)鉤體種(L.interrogans),這將為貴州省鉤體病的分子流行病學(xué)研究提供依據(jù),有利于今后鉤體分離菌株的比對(duì)和分析。然而,由于分離菌株數(shù)量有限,要更深入地闡述貴州省鉤體菌型分布與流行特征還需要更進(jìn)一步研究。

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Lep tospira inter rogans isolates by pulsed-field gel electrophoresis typing and genospecies identification in Guizhou Province

L IShi-jun,ZHANG Cui-cai,L IXiu-wen,TANG Guang-peng,TIAN Ke-cheng,L IU Ying,CA IXing-he,YU Chun,Nie Yi-xin,JIANG Xiu-gao

(Institute for Comm unicable D isease Control and Prevention,Guizhou Provincial Centers for Disease Control and Prevention,Guiyang 550004,China)

The aim of the study was to perform amolecular epidemiological investigation on the Leptospira isolates from animal hosts in Guizhou p rovince by using pulsed-field gel electrophoresis(PFGE)molecular typing and 16S rRNA gene sequencing based species-specific identification.The extracted chromosomal DNA from lep tospiral isolates were digested with restriction endonuclease No t Iand the DNA segments were separated by using PFGE.By BioNumerics V 4.0 software and 75%similarity as the standard,theobtained PFGE images from lep tospiral isolatesweremanaged and then the PFGEmapsof lep tospiral isolates were compared with those of reference strains belonging to l5 Serovar l5 serogroupsof L.interrogans for cluster analysis.Besides,species-specific identification of those three Lep tospira isolates were performed by 16S rRNA gene sequencing and analysis.PFGE analysis indicated that 3 strainsof L.interrogans from Guizhou p rovincewere classified in to two PFGE types,and both of the two PFGE types belonged to the Serovar-groups Icterohaemorrhagiae Serovar Lai strain Lai.16S rRNA gene sequencing and analysis demonstrated the sequencesof 16S rRNA gene of the 3 strainswere identical,with homogeny as 100%.And the homogeny of 16S rRNA gene between the three isolated strains and Leptospira reference strains of different serovar types contained in L.interrogans species was 100%.The results revealed that 3 strains of L.interrogans isolated from Guizhou p rovince belonged to Serovar-groups Icterohaemo rrhagiae Serovar Lai,and belonged to L.interrogans genospecies.The identification results of PFGE typing are consistent with that of 16S rRNA analysis.It would contribute to the active surveillance,investigation of outbreak and sourcetracking for lep tospirosis in Guizhou p rovince.

L.interrogans;PFGE;16S rRNA;sequence analysis;homogeneity;genospecies

R378.5

A

1002-2694(2011)07-0587-05

＊貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(No.黔省專合字(2010)90號(hào))與貴州省疾病預(yù)防控制中心青年科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2009-(青2)-2)聯(lián)合資助(李世軍與張翠彩同等貢獻(xiàn))

蔣秀高,Email:Jiangxiugao@icdc.cn

1.貴州省疾病預(yù)防控制中心傳染病防治研究所,貴陽(yáng)

550004;

2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所鉤端螺旋體病室,北京 102206

2010-08-29;

2011-03-20