顧 靚，張陽德

（中南大學(xué)衛(wèi)生部肝膽腸外科研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410008）

RNA干擾沉默mTOR基因?qū)Ω伟〩epG2細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

顧 靚，張陽德*

（中南大學(xué)衛(wèi)生部肝膽腸外科研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410008）

目的：探討RNA干擾技術(shù)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞mTOR的表達(dá)及細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的影響。方法：體外合成mTOR siRNA，并轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞24 h，同時(shí)設(shè)無義對(duì)照組（轉(zhuǎn)染無義對(duì)照siRNA）、空白對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體）及正常對(duì)照組（不轉(zhuǎn)染）。采用western blot法檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞的mTOR蛋白表達(dá)；應(yīng)用Transwell小室細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后肝癌HepG2細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)，評(píng)價(jià)肝癌細(xì)胞體外侵襲和轉(zhuǎn)移能力的變化。結(jié)果：mTOR siRNA轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞mTOR蛋白的表達(dá)低于各對(duì)照組（P＜0.05）；HepG2細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移力均顯著低于各對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論：mTOR siRNA可有效抑制HepG2細(xì)胞mTOR蛋白的表達(dá)，且能抑制HepG2細(xì)胞的侵襲和遷移。

原發(fā)性肝癌；HepG2細(xì)胞；mTOR；RNA干擾；HepG2細(xì)胞；侵襲；轉(zhuǎn)移

原發(fā)性肝癌是原發(fā)于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤之一。肝癌起病隱匿，發(fā)展迅速，惡性程度高，一旦發(fā)現(xiàn)多為中晚期，不論是手術(shù)還是姑息治療，效果均不理想。由于肝癌是一種高侵襲、高轉(zhuǎn)移性癌癥，臨床治療又易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，使療效難以提高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)肝癌的死亡率在我國(guó)各種惡性腫瘤中高居第二位，占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的18.8%，每年有10萬人以上死于肝癌[1-2]。因此，如何阻斷癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移，是目前肝癌研究的熱點(diǎn)之一。本研究旨在研究RNA干擾沉默mTOR基因?qū)Ω伟〩epG2細(xì)胞遷移和侵襲力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌HepG2細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，含高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。RPMI-1640購(gòu)自美國(guó) Gibco公司。T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。脂質(zhì)體Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。兔抗人mTOR單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。兔抗人actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司?；|(zhì)膠Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存于液氮中的肝癌HepG2細(xì)胞株取出，迅速放入37～40℃水浴箱中，使其在1 min內(nèi)融化，無菌條件下打開安瓿，將細(xì)胞懸液吸取到培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃）中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，換培養(yǎng)液一次，至細(xì)胞長(zhǎng)成單層后即開始傳代。吸去培養(yǎng)液，加1 ml 0.25%胰蛋白酶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶覆蓋整個(gè)瓶底。室溫消化3～5 min。鏡下見細(xì)胞皺縮，間距增大時(shí)，滴加幾滴培養(yǎng)液終止消化。加10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液充分吹打，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，加入10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液的量為原加入量的2倍，即一瓶傳成兩瓶，置于培養(yǎng)箱內(nèi)約3 d形成單層即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 siRNA的體外合成及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 siRNA的體外合成參照T7 RiboMAXTMExpressRNAi System試劑盒說明書操作，應(yīng)用40 g/L瓊脂糖凝膠電泳，測(cè)定siRNA的長(zhǎng)度和濃度，預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出1段干擾效果較好的特異性siRNA，同時(shí)體外轉(zhuǎn)錄合成1段無義對(duì)照siRNA。將細(xì)胞分為4組：正常對(duì)照組（不加轉(zhuǎn)染試劑）、空白對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體）、無義對(duì)照組（轉(zhuǎn)染無義對(duì)照 siRNA）、mTOR siRNA轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染組應(yīng)用Lipofecter脂質(zhì)體將150 nmol/L mTOR siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 western-blot法檢測(cè)mTOR蛋白質(zhì)表達(dá) 轉(zhuǎn)染結(jié)束后將細(xì)胞裂解液加入培養(yǎng)板中提取蛋白質(zhì)，用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。每例標(biāo)本取總蛋白60 μg加熱至100℃10 min，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后用半干式電轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜90 min將膜取出，用蒸餾水沖洗，放入5%脫脂奶粉中，37℃搖床上封閉1 h。再將膜放入mTOR的一抗（兔抗人mTOR單克隆抗體，濃度為中1∶400）中4℃孵育過夜，洗膜后放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠的二抗（1∶2 000）中37℃孵育1 h，洗膜后DAB顯色待出現(xiàn)明顯條帶時(shí)，用蒸餾水終止反應(yīng)。以β-actin（43kD）為內(nèi)參。凝膠成像系統(tǒng)拍照，獲得的圖像用軟件ImageTool 3.0測(cè)灰度值，并與內(nèi)參相比得其相對(duì)值，取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均值進(jìn)行比較。

1.2.4 體外細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備成3×105個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液。Transwell小室正反面分別在超凈臺(tái)紫外線照射滅菌2 h，無菌條件下在24孔Transwell上室聚碳酸酯膜（PVPF膜，孔徑8μm）上包被1 mg/ml的Matrigel膠50 μl，37℃放置30 min，使之在微孔濾膜上重組為基底膜結(jié)構(gòu)。在上室的微孔中分別加入上述4組單細(xì)胞懸液各100 μl，下室加入含15%FBS的DMEM培養(yǎng)液500 μl作為趨化因子，每組細(xì)胞設(shè)5個(gè)復(fù)孔。置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，取出Transwell小室，用棉簽仔細(xì)擦去上室面剩余培養(yǎng)基和未發(fā)生轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，室溫干燥30 min。用0.1%結(jié)晶紫在37℃條件下染色30 min。光學(xué)顯微鏡下觀察侵襲至膜上的細(xì)胞數(shù)，每個(gè)復(fù)孔取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，并取均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 體外細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 將Transwell小室超凈臺(tái)紫外線照射滅菌2 h，在上室的微孔中分別加入4組細(xì)胞的單細(xì)胞懸液（3×105個(gè)/ml）100 μl，隨后在下室加入含15%FBS的DMEM培養(yǎng)液500 μl，每組細(xì)胞設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)、染色、計(jì)數(shù)方法同侵襲實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 siRNA沉默mTOR基因的效率

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，正常對(duì)照組、空白對(duì)照組、無義對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度分別是 1.35±0.22、1.34±0.26、1.34±0.19，3組間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；mTOR siRNA轉(zhuǎn)染組的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度為0.57±0.13，與各對(duì)照組比較均顯著降低（P＜0.05）。見圖1，其中A組為mTOR siRNA轉(zhuǎn)染組，B組為正常對(duì)照組、C組為空白對(duì)照組、D組為無義對(duì)照組。

2.2 體外細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)結(jié)果

HepG2細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，siRNA mTOR轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞，穿過Transwell小室Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)較正常對(duì)照組顯著減少（P＜0.05），空白對(duì)照組、無義對(duì)照組與正常對(duì)照組比較則無顯著性差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，RNA干擾沉默mTOR基因能降低肝癌HepG2細(xì)胞的侵襲力。見表1。

表1 侵襲實(shí)驗(yàn)各組HepG2細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)的比較（±s）Tab.1 Comparison of transmembrane cell count of HepG2 cell by invasion assay(±s)

表1 侵襲實(shí)驗(yàn)各組HepG2細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)的比較（±s）Tab.1 Comparison of transmembrane cell count of HepG2 cell by invasion assay(±s)

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05*P＜0.05,vs normal control group

組別 n 穿膜細(xì)胞數(shù)正常對(duì)照組空白對(duì)照組無義對(duì)照組mTOR siRNA組5 5 5 5 86.60±6.88 89.20±7.92 86.60±4.83 44.60±5.41*

2.3 體外細(xì)胞遷移能力檢測(cè)結(jié)果

HepG2細(xì)胞體外遷移中，各組透過人工膜的細(xì)胞數(shù)見表2。siRNA mTOR轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞數(shù)量比正常對(duì)照組顯著減少（P＜0.05），這說明RNA干擾沉默mTOR基因能降低肝癌HepG2細(xì)胞的遷移力。而空白對(duì)照組、無義對(duì)照組間與正常對(duì)照組比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。

表2 遷移實(shí)驗(yàn)各組HepG2細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)的比較（±s）Tab.2 Comparison of transmembrane cell count HepG2 cells in each migration group(±s)

表2 遷移實(shí)驗(yàn)各組HepG2細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)的比較（±s）Tab.2 Comparison of transmembrane cell count HepG2 cells in each migration group(±s)

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05*P＜0.05,vs normal control group

組別 n 穿膜細(xì)胞數(shù)正常對(duì)照組空白對(duì)照組無義對(duì)照組mTOR siRNA組5 5 5 5 145.60±4.93 145.00±5.83 140.60±6.91 93.00±4.85*

3 討論

原發(fā)性肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)是原發(fā)性肝癌的高發(fā)區(qū)。肝癌起病隱匿，發(fā)展迅速，惡性程度高，一旦發(fā)現(xiàn)多為中晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，而化療、放療等姑息性治療，效果亦不理想。雖然早期患者手術(shù)切除是首選的治療方法，但由于85%～90%的肝癌患者伴有肝硬化，較差的肝功能和腫瘤的多中心性生長(zhǎng)，患者也往往不能耐受較大范圍的肝臟切除術(shù)，并且約有一半的手術(shù)患者容易病情復(fù)發(fā)。侵襲和轉(zhuǎn)移是肝癌難于治療，導(dǎo)致死亡的主要原因。因此，進(jìn)一步深入研究肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展出有效的干預(yù)手段，對(duì)于提高肝癌患者的治療水平有重要意義。

近幾年來，與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)不斷被發(fā)現(xiàn)。最近發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 （mammalian target of rapamycin，mTOR）與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在感受營(yíng)養(yǎng)信號(hào)、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖中起著關(guān)鍵性的作用。mTOR被認(rèn)為是磷脂酰肌醇 3-激酶相關(guān)激酶 （phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）-related kinase，PIKK）蛋白質(zhì)家族成員，因?yàn)樵趍TOR的C末端有一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域，約234個(gè)氨基酸。mTOR可在多種因素的活化下參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯起始、核糖體生物合成、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能，在細(xì)胞生長(zhǎng)中處于核心地位[3]。近年來發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤都伴有mTOR信號(hào)通路的異常，mTOR在腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的多種生理病理過程如細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞遷移等發(fā)揮了重要作用[4-6]。

研究發(fā)現(xiàn)TOR信號(hào)通路的活化與肝癌的發(fā)生也有密切關(guān)系，抑制TOR信號(hào)通路能夠在一定程度上阻止肝癌的進(jìn)展。Sahin等[7]報(bào)道，肝細(xì)胞癌組織中mTOR表達(dá)增加，且mTOR磷酸化水平顯著增強(qiáng)，mTOR特異性抑制劑雷帕霉素預(yù)處理肝癌細(xì)胞株后，能顯著抑制細(xì)癌胞的增殖。國(guó)外學(xué)者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，mTOR另一特異性抑制劑西羅莫司對(duì)于肝癌也有良好的治療效果[8]。黃酮類化合物水飛薊賓具有很好的抗癌作用，但其作用機(jī)制尚不清楚。最近有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓能顯著抑制HIF-1的累積及其轉(zhuǎn)錄活性，而HIF-1alpha在肝細(xì)胞癌血管發(fā)生、侵襲力、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，但是水飛薊賓既不影響HIF-1alpha的降解速度也不影響其穩(wěn)態(tài)的mRNA水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓抑制HIF-1alpha與其對(duì)mTOR及其下游底物p70S6K、4E-BP1很強(qiáng)的去磷酸化作用有關(guān)[9]。Ladu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，E2F1在人類和嚙齒動(dòng)物肝癌中都可能是關(guān)鍵的抗細(xì)胞凋亡因子，其機(jī)制與通過拮抗由PIK3CA/Akt/mTOR途徑激活介導(dǎo)的c-Myc促凋亡作用。以上研究證明，mTOR參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展，但其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

RNA干擾也被稱為基因沉默療法，是近年來發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來的新型基因阻斷技術(shù)，主要利用雙鏈RNA誘發(fā)對(duì)宿主細(xì)胞特異性RNA轉(zhuǎn)錄的抑制，從而抑制特異性基因的表達(dá)，具有特異性強(qiáng)、效率高的特點(diǎn)。RNA干擾是基因調(diào)節(jié)的有效工具，在疾病的治療方面顯示了廣闊的前景[11]。RNA干擾在腫瘤研究領(lǐng)域也有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，針對(duì)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、端粒酶、信號(hào)傳導(dǎo)通路、新生血管、細(xì)胞因子及其受體基因等不同位點(diǎn)而設(shè)計(jì)的小干擾RNA對(duì)腫瘤均有明顯的阻抑作用，RNA干擾技術(shù)的迅速發(fā)展為腫瘤分子靶向治療開辟了新的途徑和領(lǐng)域[12-13]。

本研究結(jié)果表明，RNA干擾技術(shù)可以顯著沉默靶基因mTOR表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，正常對(duì)照組、空白對(duì)照組、無義對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度分別是1.35±0.22、1.34± 0.26、1.34±0.19，這3組的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；mTOR siRNA轉(zhuǎn)染組的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度為（0.57±0.13），與各對(duì)照組比較均顯著降低（P＜0.05）。通過RNA干擾特異性地抑制基因的表達(dá)來闡明基因在生物體中的功能，較傳統(tǒng)方法如基因敲除省時(shí)方便。例如使用基因敲除技術(shù)敲除一個(gè)基因需要6～12個(gè)月，而本研究使用RNA干擾技術(shù)可以在瞬時(shí)抑制目的基因的表達(dá)。本研究結(jié)果還提示，RNA干擾靶向干預(yù)mTOR基因的表達(dá)后，能顯著降低肝癌HepG2細(xì)胞的侵襲力和遷移力。因此，在肝癌靶向基因治療研究中，mTOR可能成為重要的靶標(biāo)之一。通過RNA干擾技術(shù)沉默mTOR基因，阻止肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，將為臨床上提高肝癌防治水平提供一種新的策略。

[1]Bosch FX,Ribes J,Diaz M,et al.Primary liver cancer:worldwide incidence and trends[J].Gastroenterology,2004,127(5):5-16.

[2]Lai EC,Lau WY.The continuing challenge of hepatic cancer in Asia[J]. Surgeon,2005,3(3):210-215.

[3]Bai X,JiangY.Keyfactors in mTOR regulation[J].Cell Mol Life Sci,2010,67 (2):239-253.

[4]Menon S,Manning BD.Common corruption of the mTOR signaling network in human tumors[J].Oncogene,2008,27(Suppl 2):S43-51.

[5]Lasithiotakis KG,Sinnberg TW,Schittek B,et al.Combined inhibition of MAPK and mTOR signaling inhibits growth,induces cell death,and abrogates invasive growth of melanoma cells [J].J Invest Dermatol. 2008,128(8):2013-2023.

[6]彭秋平,梁后杰,馮青青,等.阻斷mTOR表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制[J].腫瘤防治研究,2010,37(3):291-293.

[7]Sahin F,Kannangai R,Adegbola O,et al.mTOR and p70S6 kinase expression in primary liver neoplasms[J].Clin Cancer Res,2004,10(24): 8421-8425.

[8]Rizell M,Lindner P.Inhibition of mTOR suppresses experimental liver tumours[J].Anticancer Res,2005,25(2A):789-793.

[9]García-Maceira P,Mateo J.Silibinin inhibits hypoxia-inducible factor-1 alpha and mTOR/p70S6K/4E-BP1 signalling pathway in human cervical and hepatoma cancer cells:implications for anticancer therapy[J]. Oncogene,2009,22,28(3):313-324.

[10]Ladu S,Calvisi DF,Conner EA,et al.E2F1 inhibits c-Myc-driven apoptosis via PIK3CA/Akt/mTOR and COX-2 in a mouse model of human liver cancer[J].Gastroenterology,2008,135(4):1322-1332.

[11]Barik S.Silence of the transcripts:RNA interference in medicine[J].J Mol Med,2005,83(10):764-773.

[12]BorkhardtA.Blockingoncogenesinmalignant cells by RNA interferencenew hope for a highly specific cancer treatment [J].Cancer Cell, 2002,2:167-168.

[13]張志宏,韓盛璽,邱春華,等.RNA干擾survivin基因靶向治療大腸癌[J].世界華人消化雜志,2007,15(36):3803-3808.

Effect of mTOR gene inhibition by siRNA on invasion and metastasis of human Hepatoma HepG2 cells

GU Liang,ZHANG Yangde*
(Ministry of Health,Central South University,Hepatobiliary&Enteric Surgery Research Center,Changsha City,Hu′nan Province,Changsha 410008,China)

Objective:To study the effect of mTOR siRNA on the expression of mTOR gene,cell invasion and metastasis of human Hepatoma HepG2 cell.Methods:The oligonucleotide templates of mTOR siRNA were designed primarily,then were used to transfect HepG2 with 24 h,and the control groups were established accordingly by using siRNA with insignificant order,liposome only and no transfection.The level of protein of mTOR was measured by western blot. Transwell chamber in vitro was to detect the cell count which were able to invade matrigel membrane to assess the ability of cell invasion and metastasis.Results:The expression of mTOR protein in the groups transfected with mTOR siRNA was lower than that of the control groups(P＜0.05).The invasion and metastasis of HepG2 cells transfected with mTOR siRNA were decreased than those of the control groups (P＜0.05).Conclusion:RNA interference of mTOR in HepG2 cell line could effetively restrain the expression of mTOR,which could significantly inhibit the invasion and metastasis of HepG2 cell.

Hepatocellular carcinoma;HepG2 cells;mTOR;RNA interference;Invasion;Metastasis

R735.7

A

1673-7210（2011）02（c）-014-03

*通訊作者

2010-12-10）