嚴(yán)鵬科 趙 慧 黃 煌 梅崢嶸 段才聞

1.廣州醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院藥劑科，廣東廣州 510150；2.南華大學(xué)病理研究所，湖南衡陽 421001；3.南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南衡陽 421001

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，均呈明顯的新生血管依賴性。因?yàn)樾律苁翘峁┎±斫M織養(yǎng)分保證腫瘤生長增殖的基礎(chǔ)，同時(shí)，腫瘤新生的血管使得腫瘤細(xì)胞與個(gè)體的血管循環(huán)系統(tǒng)直接相通，這也是惡性腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移播散的必要條件。在實(shí)體腫瘤中，微血管網(wǎng)絡(luò)承擔(dān)著輸送營養(yǎng)物質(zhì)和排泄代謝廢物的作用，是腫瘤生長和復(fù)發(fā)不可缺少的前提條件之一。腫瘤要達(dá)到1～2 mm3以上[1]，必須生成新的血管以阻止腫瘤細(xì)胞的凋亡。因此，如何有效的截?cái)嗄[瘤的血供、抑制新生血管，已經(jīng)成為腫瘤治療及防止腫瘤擴(kuò)散的研究方向。血管生成方面的研究很多，目前已有藥物應(yīng)用于臨床，通過阻斷腫瘤血管生成抑制其生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，其療效不令人滿意，因?yàn)檠苌傻年P(guān)鍵調(diào)控因素尚不清楚。

Jagged 1是哺乳動(dòng)物中第一個(gè)被證實(shí)的Notch受體的配體，參與調(diào)控許多組織的生長發(fā)育，在肌肉形成、神經(jīng)、血管發(fā)生和維持正常造血前體細(xì)胞及其增殖等過程中起著重要作用[2]，Jagged 1在腫瘤新生血管形成中也起了重要的作用，它在新生血管形成與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移中的作用受到越來越多的關(guān)注。本研究建立雞胚絨毛尿囊膜模型，動(dòng)態(tài)觀察血管發(fā)育不同時(shí)期Jagged 1的表達(dá)，探討Jagged 1與血管發(fā)育的關(guān)系，并在正常的結(jié)直腸組織和不同大小結(jié)直腸癌組織中觀察Jagged 1的表達(dá)，為腫瘤的治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.HY926，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心引進(jìn)。種蛋購自衡陽聯(lián)合養(yǎng)雞公司，選用新鮮、大小適中的優(yōu)質(zhì)種蛋，半自動(dòng)孵化箱自行孵育。在解放軍169醫(yī)院批準(zhǔn)同意和告知患者家屬同意后，收集解放軍169醫(yī)院外科手術(shù)切除的結(jié)直腸癌旁正常黏膜組織5例，結(jié)直腸癌新鮮標(biāo)本15例，其中男11例，女4例；年齡28～75（平均56.9）歲；腫塊直徑≤3 cm患者、3 cm＜腫塊直徑≤5 cm患者、腫塊直徑＞5 cm患者各5例，手術(shù)切除的血管瘤旁正常皮膚組織和皮膚血管瘤新鮮標(biāo)本各8例，其中男4例，女4例；年齡8～32（平均20.1）歲，所有標(biāo)本均由病理組織學(xué)診斷證實(shí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 內(nèi)皮細(xì)胞用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、5% CO2的恒濕培養(yǎng)箱中。細(xì)胞呈單層生長，鋪滿培養(yǎng)瓶后傳代。傳代時(shí)常規(guī)吸去培養(yǎng)液，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，立即傾去胰酶，加適量含血清培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 雞胚的培養(yǎng)及雞胚絨毛尿囊膜模型的制備 新鮮受精雞卵以1‰新潔爾滅清洗后放入60%相對(duì)濕度的孵育箱內(nèi)孵育，呈45°夾角，有氣室的一頭向上，1～10 d溫度設(shè)定為37.8℃，11～19 d設(shè)定為37℃，20～21 d設(shè)定為36.8℃，每天翻蛋2～3次。從雞胚發(fā)育的第1天開始，每隔24 h剝開一批種蛋（每批5枚），觀察雞胚絨毛尿囊膜的生長情況，直到第21天。剝制時(shí)，用眼科鑷在種蛋的氣室一端輕敲一個(gè)直徑為0.5 cm的小洞，沿著洞的周圍，用眼科鑷慢慢夾掉卵殼，輕輕揭開卵殼膜，注意勿傷及血管，暴露整個(gè)尿囊膜部分。以甲醇和丙酮混合液（1︰1）室溫固定15 min，剝離尿囊膜，鋪在培養(yǎng)皿中，陰干保存。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 染色方法按照鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法試劑盒說明書步驟操作。用已知陽性表達(dá)的組織做陽性對(duì)照，PBS代替一抗做陰性對(duì)照，結(jié)果以細(xì)胞膜和（或）胞漿出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。

1.2.4 Western blotting 冰上稱取組織100 mg，加蛋白裂解液進(jìn)行蛋白抽提，應(yīng)用Bradford法測定蛋白質(zhì)含量。每樣本取30 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉-PBST室溫封閉1 h，PVDF膜分別與Jagged 1抗體、β-actin抗體4℃孵育過夜，再與HRP標(biāo)記的二抗體37℃孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯色后用凝膠成像系統(tǒng)掃描，半定量分析顯影帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Jagged 1在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.HY926中的表達(dá)

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，Jagged 1主要在內(nèi)皮細(xì)胞胞膜上呈陽性表達(dá)，胞漿中呈弱陽性表達(dá)，核表達(dá)為陰性，見圖1。

圖1 Jagged 1在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.HY926中的表達(dá)（×400）

2.2 雞胚絨毛尿囊膜動(dòng)態(tài)血管發(fā)育模型觀察

第4.5天的雞胚絨毛尿囊膜發(fā)育情況見圖2A，胚胎繼續(xù)發(fā)育，卵黃膜已覆蓋大部分表面，肉眼可見雞胚心臟跳動(dòng)，尿囊膜開始發(fā)育，為一小水泡狀，尿囊膜上可以看到細(xì)小的血管，但血管網(wǎng)不完善，只能觀察到較細(xì)的血管和外周的血管環(huán)，血管內(nèi)血液充盈不足，顏色偏淡不易觀察，所以取第4.5天為雞胚絨毛尿囊膜血管發(fā)育初生期的時(shí)間點(diǎn)。第8天的雞胚絨毛尿囊膜發(fā)育情況見圖2B，這時(shí)到了雞胚器官發(fā)育末期，雞胚絨毛尿囊膜已包圍了大部分卵黃囊，尿囊膜上出現(xiàn)主干血管由胚胎向四周延伸，紋理清晰，大血管繼續(xù)發(fā)育增粗，血管網(wǎng)進(jìn)一步發(fā)育，可以觀察到毛細(xì)血管網(wǎng)，小血管的數(shù)量及分支都有增加。第12天的雞胚絨毛尿囊膜發(fā)育情況見圖2C，此時(shí)尿囊膜已幾乎完全覆蓋了胚胎、卵黃囊和卵清，新血管達(dá)到高峰，較8日齡時(shí)增加達(dá)三倍之多，可見其上密集的血管網(wǎng)絡(luò)，有豐富的粗大的血管，血管發(fā)育已完善，血管密度不再增加，主干血管清晰，呈樹狀均勻分布，血管間隙明顯，小血管發(fā)育完全，所以取第12天為雞胚絨毛尿囊膜血管發(fā)育旺盛期的時(shí)間點(diǎn)。第16天的雞胚絨毛尿囊膜發(fā)育情況見圖2D，血管開始退化，明顯稀疏，細(xì)小的血管幾乎已不可見，所以取第16天的雞胚絨毛尿囊膜為血管發(fā)育消退期的時(shí)間點(diǎn)。第20天的雞胚絨毛尿囊膜發(fā)育情況見圖2E，大部分血管已萎縮不可見，只見殘留的幾根細(xì)小的血管。

圖2 雞胚尿囊膜動(dòng)態(tài)血管發(fā)育模型

2.3 免疫熒光檢測雞胚絨毛尿囊膜血管中Jagged 1的表達(dá)

雞胚尿囊膜發(fā)育至4.5 d時(shí)，Jagged 1表達(dá)于剛開始發(fā)育的細(xì)小血管、血管分叉處的莖細(xì)胞且表達(dá)量少。雞胚尿囊膜發(fā)育至8 d時(shí)，Jagged 1表達(dá)于較為粗大的主干血管、未成熟完善的血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、小血管、分支及毛細(xì)血管網(wǎng)。雞胚尿囊膜發(fā)育至12 d時(shí)，Jagged 1廣泛表達(dá)于密集、發(fā)育完善的血管網(wǎng)絡(luò)、豐富粗大的血管和各血管的分叉處。雞胚尿囊膜發(fā)育至16 d時(shí)，Jagged 1在明顯稀疏的各粗大血管中表達(dá)。雞胚尿囊膜發(fā)育至20 d時(shí)，只有殘留的幾根細(xì)小血管依稀可見，Jagged 1表達(dá)減少，見圖3。

2.4 Western blot檢測雞胚絨毛尿囊膜血管中Jagged 1的表達(dá)

為進(jìn)一步證實(shí)不同血管發(fā)育期Jagged 1的表達(dá)變化，筆者選取胚齡為4.5、8、12、16和20 d的雞胚絨毛尿囊膜，提取蛋白，Western blot檢測Jagged 1表達(dá)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Jagged 1的變化呈先升高后降低的態(tài)勢(shì)，即為從第4.5天（血管發(fā)育初生期）開始，表達(dá)逐漸上調(diào)，胚齡12 d（血管發(fā)育旺盛期）的表達(dá)量最多，隨后Jagged 1的表達(dá)逐漸降低，胚齡16 d（血管發(fā)育消退期）的表達(dá)量明顯減少，至胚齡20 d表達(dá)量降至最低，見圖4。

圖4 Western blot檢測雞胚絨毛尿囊膜血管中Jagged 1蛋白表達(dá)

2.5 免疫組化檢測正常結(jié)直腸黏膜和結(jié)直腸癌中Jagged 1的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，正常的結(jié)直腸黏膜中，Jagged 1表達(dá)于血管的內(nèi)皮組織，血管間的結(jié)締組織和腸絨毛表達(dá)陰性。結(jié)直腸癌細(xì)胞和腫瘤血管表達(dá)Jagged 1蛋白，其表達(dá)量與腫瘤體積，血管密度呈正比，Jagged 1廣泛表達(dá)于腫瘤組織中新生的毛細(xì)血管和小血管，見圖5。

圖5 Jagged 1在正常結(jié)直腸黏膜和不同體積的結(jié)直腸癌腫塊中的表達(dá)

2.6 Western blot 檢測正常結(jié)直腸黏膜和結(jié)直腸癌中Jagged 1的表達(dá)

選取正常結(jié)直腸黏膜及大、中、小三個(gè)體積不同的結(jié)直腸癌腫塊，分別提取蛋白，Western blotting檢測Jagged 1表達(dá)量的變化。其結(jié)果與免疫組化結(jié)果相符，Jagged 1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)量大大高于在正常結(jié)直腸黏膜中的表達(dá)量。腫瘤體積越大，血管生成越多，Jagged 1表達(dá)量越高，見圖6。

3 討論

雞胚絨毛尿囊膜模型是研究血管生成的經(jīng)典方法，雞胚尿囊膜血管是研究血管生長常用的觀測部位，此研究方法經(jīng)濟(jì)，且實(shí)驗(yàn)方法簡單、易操作[3-4]。雞胚絨毛尿囊膜血管的發(fā)育存在一個(gè)顯著的特點(diǎn)，即從第1天孵育到第21天雛雞出殼，尿囊膜上的血管會(huì)經(jīng)歷一個(gè)從無到有，從初生到旺盛、然后漸漸消退的過程，由此可以連續(xù)地研究血管發(fā)育過程中各種生長因子和抑制因子的變化。

Notch家族原本指果蠅中的一種特定的突變形式，是一個(gè)進(jìn)化上十分保守的跨膜受體蛋白家族，它通過與其表達(dá)配體的相鄰細(xì)胞相互作用實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信號(hào)傳遞，從而決定動(dòng)物發(fā)育過程中多種細(xì)胞的命運(yùn)。研究顯示Notch信號(hào)通路與腫瘤密切相關(guān)，在不同狀況下，分別充當(dāng)癌基因或抑癌基因[5]。Jagged 1是哺乳動(dòng)物中第1個(gè)被證實(shí)的Notch受體的配體，研究表明，Jagged 1能單獨(dú)或通過激活Notch信號(hào)通路影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且參與了腫瘤的新生血管化[6]。Jagged 1在小鼠卵巢血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)有助于小鼠卵子發(fā)生和卵巢血管形成[7]，Jagged 1基因敲除小鼠會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的胚胎和卵黃膜血管重塑缺陷，導(dǎo)致小鼠在胚胎發(fā)育11.5 d死亡，表現(xiàn)為血管發(fā)育異常和廣泛出血[8]。Jagged 1基因敲除小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞不能形成良好的網(wǎng)狀環(huán)樣結(jié)構(gòu)，內(nèi)皮細(xì)胞伸出端狀態(tài)異常，細(xì)胞遷移和形成細(xì)胞間相互連接的能力下降，血管發(fā)育重塑障礙，表明Jagged 1在胚胎血管發(fā)生中起關(guān)鍵作用[9]。

筆者前面的研究建立了雞胚絨毛尿囊膜動(dòng)態(tài)血管發(fā)育模型，觀察和分析新生血管形成、發(fā)育和消退的過程，本實(shí)驗(yàn)利用此動(dòng)態(tài)模型和尿囊膜較易剝?nèi)〉奶攸c(diǎn)，且尿囊膜血管網(wǎng)的發(fā)育隨胚齡的增加而不斷地深化，動(dòng)態(tài)地展示了血管從初生、旺盛到消退的全過程。本實(shí)驗(yàn)用免疫熒光組織化學(xué)檢測了雞胚絨毛尿囊膜中Jagged 1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)血管發(fā)育過程中Jagged 1具有表達(dá)差異，雞胚絨毛尿囊膜發(fā)育初期，血管網(wǎng)不完善，Jagged 1的表達(dá)量少。隨著新生血管的重塑和成熟，Jagged 1廣泛表達(dá)于密集、發(fā)育完善的血管網(wǎng)絡(luò)，在血管發(fā)育消退期，Jagged 1的表達(dá)相應(yīng)減少。Davis G.E和Birukova A.A等[9-10]的研究結(jié)果提示Jagged 1在血管生成中起關(guān)鍵作用，誘導(dǎo)了新生血管的形成。本研究顯示，隨著雞胚尿囊膜血管從初生、旺盛到消退，Jagged 1的表達(dá)成逐漸上調(diào)再下調(diào)趨勢(shì)。Western blot顯示正常雞胚尿囊膜組織中，隨著生理性血管的形成，血管密度越大，血供越豐富，Jagged 1表達(dá)量增加，隨著血管發(fā)育的進(jìn)入消退期，血管密度越小，血供越少，Jagged 1的表達(dá)也降低。Jagged 1表達(dá)量與新生血管形成數(shù)量成正相關(guān)。因此筆者認(rèn)為Jagged 1在血管生成中起關(guān)鍵作用，誘導(dǎo)了新生血管的形成。

血管生成是腫瘤生長和擴(kuò)散的必要條件，1971年，F(xiàn)olkman指出“腫瘤生長依賴血管生成”，后又提出血管生成切換的概念，由此把惡性腫瘤的生長分為血管前期和血管化期。血管前期中，腫瘤細(xì)胞處于休眠狀態(tài)或原位癌，腫瘤組織的營養(yǎng)及代謝產(chǎn)物的傳送依賴與宿主組織間的相互彌散，從而進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的克隆性增殖，由此腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生和死亡基本平衡，腫瘤生長非常緩慢，不表現(xiàn)過度生長[11]，最大直徑不超過1～3 mm，此時(shí)如果腫瘤組織內(nèi)無新生的毛細(xì)血管和小血管形成而建立新的血供，則腫瘤將停止生長或退化。從血管前期到血管化期的轉(zhuǎn)化稱為“血管生成開關(guān)”，一但腫瘤經(jīng)歷“開關(guān)”轉(zhuǎn)化就進(jìn)入了血管化期，血管化期對(duì)腫瘤組織的持續(xù)生長非常重要。在此期間，促進(jìn)腫瘤生長的血管形成刺激因子占優(yōu)勢(shì)，抑制因子減少，將有大量的腫瘤血管生成，進(jìn)而形成腫瘤組織的血管系統(tǒng)，完善了腫瘤組織的血液供應(yīng)，腫瘤所需的氧、營養(yǎng)物由血管灌注供應(yīng)，提供了腫瘤組織生存和發(fā)展的必要條件，腫瘤呈不可控制性生長。腫瘤新生血管結(jié)構(gòu)缺乏完整性，管壁薄弱，僅排列一層內(nèi)皮細(xì)胞，缺乏平滑肌，基底膜變薄或者缺如，使它們比正常成熟血管更容易被腫瘤細(xì)胞穿透，再者，血管生成本身就具有一定的組織侵襲性，腫瘤細(xì)胞可以沿著新生血管所開啟的膠原裂隙侵襲，也可以進(jìn)入血液循環(huán)在遠(yuǎn)離腫瘤的部位形成轉(zhuǎn)移灶。因此，抑制血管生成可能是抗腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的有效途徑。建立各種體內(nèi)血管生成模型及體外檢測與血管生成有關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)是實(shí)現(xiàn)尋找新的抗血管生成藥物的關(guān)鍵。

雞胚尿囊膜模型以雞胚本身正常的血管作為研究對(duì)象，在研究血管生成機(jī)理或與血管生成相關(guān)因子時(shí)，缺乏腫瘤血管的特異性。因此本實(shí)驗(yàn)用免疫組織化學(xué)及Western blot檢測了正常的結(jié)直腸黏膜和不同體積大小的結(jié)直腸癌腫塊中Jagged 1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Jagged 1表達(dá)于癌細(xì)胞胞膜和胞漿，且腫瘤體積越大，血管生成越多，Jagged 1的表達(dá)量越高。筆者分析Jagged 1可能通過與激活的Notch 1結(jié)合，刺激腫瘤新生血管形成從而促進(jìn)腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移。

本研究利用雞胚絨毛尿囊膜為模型，觀察到Jagged 1的表達(dá)隨血管發(fā)育而變化，Jagged 1與血管發(fā)育呈正相關(guān)，表明Jagged 1可能是新生血管形成的早期事件。筆者在正常的結(jié)直腸組織和不同大小結(jié)直腸癌組織中觀察Jagged 1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體積較大血管較豐富的結(jié)直腸癌組織，其Jagged l的表達(dá)較多，表明Jagged l的表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，Jagged l可通過與激活的Notch結(jié)合，增強(qiáng)其活性，刺激腫瘤新生血管形成從而促進(jìn)腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移。

[1] Folkman J. Proceedings:Tumor angiogenesis factor[J]. Cancer Res,1974，34(8):2109-2113.

[2] Varnum-Finney B,Purton LE,Yu M,et al. The Notch ligand,Jagged-1,influences the development of primitive hematopoietic precursor cells[J].Blood,1998,91(11):4084-4091.

[3] Kim JS,Yu HK,Ahn JH,et al. Human apolipoprotein（a) kringle V inhibits angiogenesis in vitro and in vivo by interfering with the activation of focal adhesion kinases[J]. Biochem Biophys Res Commun，2004，313(3):534-540.

[4] Crivellato E,Nico B,Vacca A,et al. Recombinant human erythropoietin induces intussusceptive microvascular growth in vivo[J]. Leukemia,2004,18(2):331-336.

[5] Nicolas M. Notch1 functions as a tumor suppressor in mouse skin[J]. Nat Genet,2003, 33(3) : 416-421.

[6] Doi H. Jagged 1-selective notch signaling induces smooth muscle differentiation via a RBP-Jkappa-dependent pathway[J]. J Biol Chem,2006,281(39) :28555-28564.

[7] Vorontchikhina MA. Unique patterns of Notch 1,Notch 4 and Jagged 1 expression in ovarian vessels during folliculogenesis and corpus luteum formation[J]. Gene Expr Patterns,2005,5(5):701-709.

[8] Xue Y,Gao X,Lindsell CE,et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged 1[J]. Hum Mol Genet,1999,8(5):723-730.

[9] Davis GE，D.R. Senger. Endothelial extracellular matrix：biosynthesis,remodeling, and functions during vascular morphogenesis and neovessel stabilization[J]. Circ Res, 2005, 97(11):1093-1107.

[10] Birukova AA. Involvement of microtubules and Rho pathway in TGF-beta1-induced lung vascular barrier dysfunction[J]. J Cell Physiol, 2005, 204(3):934-947.

[11] Reilly MS. Angiostatin:a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma[J]. Cell, 1994, 79(2):315-328.