盧 倫,方 成,胡澤斌,沈穎穎,夏 署,邵 爽

(浙江外國語學(xué)院理工學(xué)院,浙江杭州310012)

表面活性劑與蛋白質(zhì)相互作用在工業(yè)、生物、食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值,因此一直備受關(guān)注[1-3].表面活性劑分子作為一種雙親分子,它能夠和多肽以及蛋白質(zhì)等大分子發(fā)生作用,致使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)分子表面的疏水性以及生物催化活性等發(fā)生變化,對其作用方式的研究可為許多科學(xué)研究建立理論基礎(chǔ)[4].此外,表面活性劑還常用于細(xì)胞膜中蛋白質(zhì)的提取,從仿生角度考慮,蛋白質(zhì)和表面活性劑相互作用的研究可為了解蛋白質(zhì)與類脂化合物或激素類小分子的結(jié)合提供有價(jià)值的模型.

牛血清白蛋白(BSA)是哺乳動(dòng)物血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì),能夠儲存和轉(zhuǎn)運(yùn)眾多內(nèi)源性和外源性化合物[5],因?yàn)槠渚哂休^為清楚的組成和結(jié)構(gòu)且易于分離、提純,常作為模型球蛋白用于研究蛋白質(zhì)與金屬離子、藥物、染料和表面活性劑等的相互作用[6-9].蛋白質(zhì)與表面活性劑相互作用的研究,涉及蛋白質(zhì)與表面活性劑二者的作用機(jī)制、表面活性劑分子對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、構(gòu)象及功能、聚集行為等的影響,在理論和實(shí)際應(yīng)用方面都有十分重要的意義.

表面活性劑與蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)研究方法比較多,如傳統(tǒng)的表面張力法、電導(dǎo)法、電化學(xué)法和粘度法等,以及現(xiàn)代不斷發(fā)展的光譜法、圓二色譜法、小角X射線散射法、電子自旋共振光譜法和量熱法等[2-3,10-11].熒光法作為最常用的光譜方法之一,分析快捷、靈敏度高,該方法基于蛋白質(zhì)中某些氨基酸殘基周圍微環(huán)境極性的變化引起熒光發(fā)射強(qiáng)度的改變,從而分析表面活性劑與蛋白的結(jié)合效率并監(jiān)測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的變化.本文用熒光光譜法研究季銨鹽表面活性劑N-十六烷基-羥乙基-二甲基溴化銨(CHDAB)與BSA的相互作用,并運(yùn)用理論模型對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理得到猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、平均結(jié)合位點(diǎn)數(shù)等重要結(jié)合作用參數(shù),以闡明表面活性劑與BSA的結(jié)合機(jī)制及作用規(guī)律.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀 器

FP-6200型熒光分光光度計(jì)(日本,Jasco公司);Finnpipette移液器(上海雷勃分析儀器有限公司)5-50μL,20-200μL;TB-85型超級恒溫器(日本,Shimadzu公司);UPWS-10T超純水器(杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司);AB265-S電子分析天平(瑞典,METTER TOLEDO公司).

1.2 試 劑

牛血清白蛋白(BSA)購于上海伯奧生物科技有限公司,氮含量≥13.5%;N-十六烷基-羥乙基-二甲溴化銨(CHDAB)由浙江大學(xué)化學(xué)系提供(純度≥99.9%);三羥基氨基甲烷(Tris)(純度≥99.9%)、HCl(濃度為36%～38%)、NaCl(含量≥99.5%)均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水器處理的超純水.

配制pH=7.1的Tris-HCl緩沖溶液(內(nèi)含0.1 mol·L-1的NaCl以維持離子強(qiáng)度);用上述Tris-HCl緩沖溶液分別配制以下溶液備用:4.0μmol·L-1,8.0μmol·L-1,12.0μmol·L-1,15.0μmol·L-1BSA溶液;2.5×10-2mol·L-1CHDAB溶液.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

BSA熒光激發(fā)和發(fā)射光譜的測定:移取一定濃度BSA溶液于石英比色皿中,設(shè)置發(fā)射波長為280nm,狹縫寬度為5nm,在298 K下掃描250～350 nm的熒光激發(fā)光譜,測得其最大激發(fā)波長;并在其最大激發(fā)波長處,同樣條件下掃描其290～410nm的熒光發(fā)射光譜,得到最大發(fā)射波長.

用移液器分別移取一定量的上述CHDAB溶液與一定量不同濃度的BSA溶液于容量瓶中,配制成CHDAB-BSA系列混合溶液,靜置、恒溫(298K).分別測定其熒光光譜、同步熒光光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA的激發(fā)和發(fā)射光譜

由于BSA分子中色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)等氨基酸殘基可吸收270～300 nm紫外光產(chǎn)生熒光,從而成為內(nèi)源性熒光物質(zhì),其中最強(qiáng)的是Trp,其熒光最大激發(fā)波長在282 nm附近.

按上實(shí)驗(yàn)方法得到BSA的激發(fā)和發(fā)射光譜示于圖1(298K,[BSA]=8μmol·L-1).實(shí)驗(yàn)得到在本實(shí)驗(yàn)條件下BSA的最大激發(fā)波長(λex)為282nm,在此激發(fā)波長下其最大發(fā)射波長(λem)為345nm.

2.2 CHDAB對BSA的猝滅光譜

熒光猝滅是指使因外加物質(zhì)導(dǎo)致熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度減小的過程.分子間相互作用能導(dǎo)致熒光猝滅,包括分子間的碰撞、激發(fā)態(tài)與基態(tài)分子之間的反應(yīng)、分子重排、能量轉(zhuǎn)移以及形成基態(tài)復(fù)合物等.其猝滅機(jī)理通常劃分為兩類:靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅.靜態(tài)猝滅主要是由于基態(tài)熒光分子與猝滅劑之間通過弱的結(jié)合生成復(fù)合物所致[12];動(dòng)態(tài)猝滅則是由于激發(fā)態(tài)熒光分子與猝滅劑碰撞所致.

按照上述實(shí)驗(yàn)方法,在最大激發(fā)波長(282 nm)下,固定BSA濃度,逐漸增大表面活性劑的濃度,測得298 K時(shí)CHDAB與BSA的熒光猝滅光譜.圖2示出CHDAB對BSA(8.0μmol/L)的熒光猝滅光譜及對BSA最大發(fā)射波長的影響.

由圖2(a)可得,在實(shí)驗(yàn)條件下,隨著CHDAB濃度增加,首先BSA的熒光強(qiáng)度逐漸減小,呈現(xiàn)規(guī)律性猝滅,但在CHDAB高濃度(＞250μmol·L-1)時(shí)熒光強(qiáng)度又呈現(xiàn)增大趨勢.298K時(shí)CHDAB的臨界膠束濃度(CMC)為840μmol·L-1[13],一般說來,在濃度低于其CMC時(shí),陽離子型表面活性劑是BSA的猝滅劑[14],本實(shí)驗(yàn)得到類似結(jié)果.

由圖2(b)可看出,隨著CHDAB濃度的增加,BSA的最大發(fā)射波長發(fā)生明顯藍(lán)移(從345nm藍(lán)移到332nm).這是由于隨著表面活性劑的加入,BSA結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊,Trp逐步暴露到表面,與表面活性劑分子發(fā)生作用,Trp周圍的微環(huán)境發(fā)生了變化,疏水性增強(qiáng)所致[17].

2.3 BSA濃度對熒光猝滅的影響

圖3示出CHDAB對不同濃度(4.0,8.0,12.0,16.0μmol/L)BSA的熒光猝滅情況.

此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CHDAB對BSA的熒光猝滅效應(yīng)與BSA濃度有關(guān):BSA濃度越小,表面活性劑對其的猝滅效應(yīng)越強(qiáng).在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),對于[BSA]為4.0,8.0μmol/L體系,I0/I隨[CHDAB]增大先增大,出現(xiàn)極大值點(diǎn),然后開始減小;對于BSA濃度高(12.0,16.0μmol/L)體系,I0/I隨[CHDAB]增大先增大,然后出現(xiàn)拐點(diǎn),進(jìn)一步出現(xiàn)平臺.

上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象反映了CHDAB與BSA的結(jié)合過程,[CHDAB]/[BSA]值越大,其對BSA的猝滅作用越強(qiáng),二者的結(jié)合作用越大,較易達(dá)到完全或飽和,其特征為I0/I-[CHDAB]曲線出現(xiàn)極大值或平臺.

2.4 Stern-Volmer猝滅常數(shù)

對于低濃度區(qū),CHDAB對BSA熒光猝滅較好符合Stern-Vo lmer方程[16]:

圖3 CHDAB對不同濃度BSA的熒光猝滅(T=298K)

式中I0為未加入猝滅劑(表面活性劑)時(shí)熒光分子(BSA)的熒光強(qiáng)度;I為猝滅劑濃度等于[D]時(shí)熒光分子的熒光強(qiáng)度,Kq為雙分子猝滅過程的速率常數(shù),τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命(生物大分子的τ0約為10-8s),Ksv稱為Stern-Volmer猝滅常數(shù).表1列出了[CHDAB]低于90μmol/L時(shí),按式(1)擬合得到不同BS A濃度時(shí)體系的Stern-Vo lmer猝滅常數(shù)Ksv、相關(guān)系數(shù)R2及計(jì)算得到的Kq.

表1 不同BSA濃度時(shí)體系的Stern-Vo lmer猝滅常數(shù)KSV及Kq,R2值

猝滅常數(shù)Ksv在一定程度上反映了CHDAB與BSA結(jié)合作用的大小.從表1可以看出,相同溫度下,隨著BSA濃度增大,Ksv減小,這主要是因?yàn)楸砻婊钚詣〤HDAB與BSA結(jié)合時(shí),其單體有一個(gè)重新分布到蛋白質(zhì)分子可鍵合位點(diǎn)的過程,但不與色氨酸殘基(Trp)發(fā)生作用,BSA濃度的增大,對表面活性劑相當(dāng)于起到一個(gè)“稀釋作用”,從而導(dǎo)致Ksv減小[17].

本實(shí)驗(yàn)得到不同BSA濃度體系的雙分子猝滅速率常數(shù)Kq均大于生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1),這是CHDAB對BSA的熒光猝滅呈現(xiàn)靜態(tài)猝滅機(jī)制特征的實(shí)驗(yàn)佐證之一.

2.5 位點(diǎn)結(jié)合模型及處理

對于靜態(tài)猝滅,可以用如下的位點(diǎn)模型來計(jì)算二者結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n[18]:

將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)將lg[(I0-I)/I]對lg[D]進(jìn)行線性回歸,得到CHDAB與不同濃度BSA的結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n及相關(guān)系數(shù)R2列于表2.

表2 CHDAB與BSA的結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n及相關(guān)系數(shù)R2

從表2可以看出,CHDAB與BSA間存在一定的結(jié)合作用,結(jié)合常數(shù)在103(L·mol-1)數(shù)量級,且基本上為單位點(diǎn)結(jié)合.BSA濃度增大,結(jié)合常數(shù)KA減小,這也可以歸結(jié)為“稀釋作用”.

2.6 CHDAB對BSA構(gòu)象的影響

固定激發(fā)波長與發(fā)射波長間距Δ λ,同步掃描可得同步熒光光譜,這種光譜可用于蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的分析[19].由Δ λ=20nm所得到的同步熒光譜圖僅顯示蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的光譜特征,而由△λ=60nm所得到的同步熒光譜圖僅表現(xiàn)出色氨酸殘基的光譜特征.

BSA濃度保持恒定,逐漸增加CHDAB的濃度,繪制BSA的同步熒光光譜.圖3中的a和b分別為BSA中酪氨酸和色氨酸殘基的同步熒光光譜圖.-1-1

圖3 BSA同步熒光光譜圖

由圖3可以看出,隨CHDAB濃度的增大,酪氨酸殘基和色氨酸殘基的最大發(fā)射波長均發(fā)生了變化,表明酪氨酸、色氨酸殘基所處的環(huán)境都發(fā)生了略微改變,即CHDAB的加入導(dǎo)致BSA的構(gòu)象發(fā)生了微弱的變化.

3 結(jié) 論

3.1 測定了pH為7.1的Tris-HCl緩沖溶液(內(nèi)含0.1 mo·lL-1的NaCl)中季銨鹽類表面活性劑CHDAB對BSA的猝滅光譜,結(jié)果表明CHDAB對BSA有熒光猝滅作用,并且導(dǎo)致最大發(fā)射波長藍(lán)移.

3.2 用Stern-Volmer方程和位點(diǎn)模型分別考察了低濃度時(shí)二者的結(jié)合參數(shù).結(jié)果表明CHDAB對BSA的猝滅效應(yīng)與BSA的濃度有關(guān)——在相同溫度下,BSA濃度越小,其Stern-Vo lmer常數(shù)Ksv和結(jié)合常數(shù)KA越大,猝滅效應(yīng)越強(qiáng).

3.3 測定了CHDAB對BSA的同步熒光光譜,結(jié)果表明CHDAB對BSA的構(gòu)象有一定影響.

[1]Fainer man V B,Zholob SA,Leser M,et al.Competitive adsorption from mixed nonionic surfactant/protein solutions[J].J Colloid Interface Sci,2004,274:496.

[2]GullN,Chodankar S,As walVK,et al.Spectroscopic studieson the interaction of cationic surfactants with bovine serum albumin[J].Colloids SurfB,2009,69:122.

[3]Mehta S K,Bhawna K K,Kumar A.Solubilization and conformational behavior of Zein in aqueous solution of dodecyldimethylethy lammonium bromide(DDAB)[J].J Colloid Interface Sci,2009,346:195.

[4]Ruiz C C,Hierrezuelo J M,Aguiar J,et al.Physicochemical studies on the interaction between N-decanoyl-N-methylglucam-ide and bovine serum albumin[J].Biomacromolecules,2007,8:2497.

[5]楊頻.生物無機(jī)化學(xué)導(dǎo)論[M].西安:西安交通大學(xué)出版社,1991:164-168.

[6]Su?kowskaa A,Wnickaa J R,Bojkoa B,et al.Interaction of drugswith bovine and human serum albumin[J].J Mol Struct,2004,691:197.

[7]邵爽,邱瑾.金屬離子對齊多夫定與牛血清白蛋白結(jié)合作用的影響[J].物理化學(xué)學(xué)報(bào),2009,25:1342.

[8]于兵川,吳洪特,周培疆.染料,藥物和環(huán)境化學(xué)污染物與血清白蛋白的相互作用[J].化學(xué)通報(bào),2005,68:1.

[9]吳丹,徐桂英.光譜法研究蛋白質(zhì)與表面活性劑的相互作用[J].物理化學(xué)學(xué)報(bào),2006,22:254.

[10]Lu R C,Cao A N,LaiL H,et al.Interaction between bovine serum albumin and equimolarly mixed cationic-anionic surfactants decyltriethylammonium bromide-sodium decyl sulfonate[J].Colloids SurfB,2005,41:139.

[11]Li Y J,Wang X Y,Wang YL.Comparative studies on interactions of bovine serum albumin with cationic gemini and single-chain surfactants[J].J Phys Chem B,2006,110:8499.

[12]LiL,Wang Y X,Song GW,et al.Bonding strength of fluorinated and hydrogenated surfactant to bovine serum albumin[J].J Fluorine Chem,2009,130:870.

[13]鄭青.DNA-陽離子表面活性劑相互作用的量熱學(xué)研究[D].杭州:浙江大學(xué),2007.

[14]Madaeni S S,Rostami E.Spectroscopic investigation of the interaction of BSA with cationic surfactants[J].Chem Eng Technol,2008,31:1265.

[15]BordbarA K,Taheri-Kafrani,Bordbar A K,et al.Binding and fluorescence study on interaction of human serum albumin(HSA)with cetyl pyridinium chloride[J].Colloids SurfB,2007,55:84.

[16]許金鉤,王尊本.熒光分析法[M].3版.北京:科學(xué)出版社,2006:64-69.

[17]Schweitzer B,Felippe A C,Dal Bo A,et al.Competitive process of binding between the anionic surfactants sodium dodecyl sulfate and sodium cholate in bovine serum albumin[J].Macromol Symp,2005,229:208.

[18]魏曉芳,劉會洲.Triton X-100與牛血清白蛋白的相互作用[J].分析化學(xué),2000,28:699-701.

[19]楊曼曼,楊頻,張立偉.熒光法研究咖啡酸類藥物與白蛋白的作用[J].科學(xué)通報(bào),1994,39(1):31-35.