方翠芬， 陳 煒， 余瀟苓， 祝 明

(1.浙江省食品藥品檢驗所，浙江杭州310004;2.杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司，浙江 杭州310016;3.浙江省中醫(yī)院，浙江杭州310006)

壯陽健威丸是由人參、肉蓯蓉、鹿茸等十六味藥組成的復(fù)方制劑，具有補腎壯陽，生精益髓的作用，用于陽虛畏寒，腰膝酸痛，陽痿。該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十冊中(標(biāo)準(zhǔn)編號為:WS3-B-1923-95)［1］，原標(biāo)準(zhǔn)僅收載了人參和制何首烏的薄層色譜鑒別和常規(guī)檢查項，經(jīng)文獻(xiàn)查閱，尚未見有壯陽健威丸中定量測定方法的報道。為控制藥品質(zhì)量，保證臨床用藥的安全性和有效性，按照國家標(biāo)準(zhǔn)提高計劃的要求，我們參考文獻(xiàn)，建立了枸杞子［2］和甘草［3］的薄層色譜鑒別，修改了人參［4］和制何首烏［5-6］的薄層色譜鑒別，制訂了主要藥味肉蓯蓉中松果菊苷的HPLC測定方法［7-9］，建立的定性、定量方法均簡便、準(zhǔn)確、專屬性強，可以有效地控制本品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

惠普1100高效液相色譜儀(惠普1100紫外檢測器)，Waters2695高效液相色譜儀(Waters2487紫外檢測器)，TU-1901紫外-可見分光光度計。

枸杞子對照藥材，人參對照藥材，甘草對照藥材，2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品，人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Re對照品，松果菊苷對照品(111670-200502，供定量測定用)，均購自中國藥品生物制品檢定所。

壯陽健威丸樣品由杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)并提供，樣品批號分別為080104、080105、080106。乙腈、甲醇為色譜純(Merck)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 枸杞子的薄層色譜鑒別 取本品3 g，粉碎，加乙醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水5 mL，微熱使溶解，離心，取上清液置于已處理好的聚酰胺柱(30～60目，內(nèi)徑1.5 cm，柱高10 cm，用水濕法裝柱)上，用水50 mL洗脫，棄去水液，再用30%乙醇50 mL洗脫，收集洗脫液，繼用50%乙醇洗脫，收集洗脫液，備用。取30%乙醇洗脫液，蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取枸杞子對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。再取按處方比例及工藝制備的枸杞子陰性對照樣品3 g，同法制成陰性對照溶液。吸取供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL、對照藥材溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸(5∶3∶2∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的藍(lán)色熒光斑點。見圖1。

圖1 枸杞子TLC圖譜

2.2 制何首烏的薄層色譜鑒別 取枸杞子薄層色譜鑒別項下的50%乙醇洗脫液，蒸干，殘渣加無水乙醇0.5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取制何首烏對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。再取2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品，加無水乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。再取按處方比例及工藝制備的制何首烏陰性對照樣品3 g，同法制成陰性對照溶液。吸取供試品溶液和陰性對照溶液各5 μL、對照藥材溶液和對照品溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸(15∶0.7∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以磷鉬酸硫酸溶液(取磷鉬酸2 g，加水20 mL使溶解，再緩緩加入硫酸30 mL，搖勻)，熱風(fēng)吹至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖2。

圖2 制何首烏TLC圖譜

2.3 人參的薄層色譜鑒別 取本品3 g，粉碎，加乙醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水15 mL使溶解，用三氯甲烷15 mL振搖提取，棄去三氯甲烷液，水層用水飽15 mL ， ，0.6鈉溶液15 mL振搖提取，堿水層備用，正丁醇液蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取人參對照藥材0.2 g，同法制成對照藥材溶液。再取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re對照品，加無水乙醇制成每1 mL含1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。再取按處方比例及工藝制備的人參陰性對照樣品3 g，同法制成陰性對照溶液。吸取供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照溶液各2 μL、對照品溶液1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光及紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點或熒光斑點。見圖3。

圖3 人參TLC圖譜

2.4 甘草的薄層色譜鑒別 取人參薄層色譜鑒別項下的備用堿水溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2，加乙酸乙酯15 mL振搖提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材0.2 g，加乙醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加0.6%氫氧化鈉溶液15 mL使溶解，用水飽和正丁醇15 mL振搖提取，分取堿液，自“用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2……”起，同法制成對照藥材溶液。再取按處方比例及工藝制備的甘草陰性對照樣品3 g，同法制成陰性對照溶液。吸取供試品溶液和陰性對照溶液各5 μL、對照藥材溶液2 μL，分別點于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光和紫外光燈(UV365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點或熒光斑點。見圖4。

圖4 甘草TLC圖譜

3 松果菊苷的測定

3.1 色譜條件 色譜柱:ZORBAX SB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);柱溫30℃;流動相乙腈-甲醇-0.1%甲酸溶液(7∶16∶77);體積流量1.0 mL/min;檢測波長330 nm。

3.2 對照品溶液的制備 取松果菊苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶解，制成每1 mL含松果菊苷28.9 μg的溶液，即得對照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備 取壯陽健威丸樣品，粉碎成細(xì)粉，取約1 g，精密稱定，精密加50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率400 W，頻率40 kHz)40 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液，即得。

3.4 陰性對照溶液的制備 取按處方比例及工藝制備的缺肉蓯蓉樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。

在上述色譜條件下，精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀測定，色譜圖見圖5，松果菊苷的保留時間為23.6 min，與相鄰組分達(dá)到基線分離，陰性對照無干擾。理論板數(shù)按松果菊苷峰計算應(yīng)不低于3 000。

圖5 HPLC色譜圖

3.5 線性關(guān)系考察 精密吸取松果菊苷系列對照品溶液(質(zhì)量濃度分別為 173.4、57.8、28.9、14.4、7.2、3.6、1.8 μg/mL)各20 μL，注入液相色譜儀，按上述條件測定峰面積，以峰面積為Y縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為X橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=1 314.4X-23.019;r=1.000 0，結(jié)果表明，松果菊苷在進(jìn)樣量0.036～3.468 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.6 儀器精密度考察 精密吸取松果菊苷對照品溶液，按上述條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果松果菊苷峰面積的RSD為1.0%(n=6)。表明儀器精密度良好。

3.7 重復(fù)性考察 取同一壯陽健威丸樣品(批號:080104)6份，按3.3項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定峰面積，計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.33 mg/g，RSD為0.7%(n=6)。

3.8 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，室溫下放置，按上述色譜條件，于 0、1、2、7、13、24、50 h 時測定，結(jié)果松果菊苷峰面積RSD為1.3%(n=7)，表明供試品溶液中松果菊苷在50 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.9 加樣回收率試驗 取已測定的壯陽健威丸樣品(批號:080104)9份，精密加入1、2、3 mL松果菊苷對照品溶液(87.75 μg/mL)，按3.3項下供試品溶液制備方法處理，測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。平均回收率為97.8%，RSD為1.2%。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果

3.10 樣品測定 按上述測定方法，對3批壯陽健威丸樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果

4 討論

4.1 HPLC測定實驗過程中，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)松果菊苷的最大吸收波長為332 nm，參考《中國藥典》［10］2005年版一部“肉蓯蓉”含量測定項下的測定波長為330 nm，考慮到紫外吸收波長掃描有一定的偏差，最終參考藥典，選擇330 nm為測定波長。

4.2 定量測定耐用性考察［11］實驗中考察了柱溫(25℃、30℃、35℃)對色譜分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柱溫的改變對供試品溶液的分離效果產(chǎn)生較大影響，而當(dāng)柱溫在30℃時，分離情況較好，故建議柱溫控制在30℃。實驗中比較了3種品牌的色譜柱:ZORBAX SB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，Diamonsil C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，依利特 Hypersil ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)，結(jié)果供試品在3種色譜柱上均能得到較好的分離。

［1］《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十冊［S］.1995:53.

［2］苗明三，李振國.現(xiàn)代實用中藥質(zhì)量控制技術(shù)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:715.

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［10］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:126.

［11］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄130.