彭招全,王 普,蔡 謹(jǐn),黃 磊,徐志南

(1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,浙江杭州 310032;2.浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程系,浙江杭州 310027)

Sanglifehrin A(SFA)是由鏈霉菌產(chǎn)生的一種新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖 1所示。生物體免疫活性在分子水平上與親環(huán)蛋白的調(diào)節(jié)作用是分不開的,而在細(xì)胞水平上主要與 T細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突細(xì)胞有關(guān)。因 SFA與親環(huán)蛋白有較強(qiáng)的親和力而表現(xiàn)出強(qiáng)大的免疫抑制活性,它與親環(huán)蛋白的親和力是目前常用的免疫抑制劑——親環(huán)菌素 A的 20倍[1],并且不會影響鈣調(diào)磷蛋白活性。SFA不僅能阻斷細(xì)胞周期 G1階段的 T細(xì)胞增殖[2],而且能在不影響 B細(xì)胞抗體合成的情況下,阻斷 B細(xì)胞增殖[3]。樹突細(xì)胞胞吞作用、攝取抗原和分泌白細(xì)胞介素 -12等免疫功能也受 SFA抑制[4,5]。此外,SFA還能抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的打開,保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血/再灌注損害[6]。它還能用來治療丙型肝炎及肝纖維化、慢性間質(zhì)性肝炎和肝細(xì)胞性肝癌等疾病[7]。然而,目前國內(nèi)外報(bào)道的 SFA發(fā)酵水平都較低,在0.1～2 mg·L-1左右[1,8],而化學(xué)法合成的步驟繁冗復(fù)雜,產(chǎn)率很低[9]。因此,提高 SFA發(fā)酵水平成為 SFA真正走向市場的瓶頸。

埃森曼在對“向日葵”住宅的解讀中，通過將虛體變?yōu)閷?shí)體來概念化空間[7]17。這種虛體被包容在物質(zhì)的邊界里，這就是空間，也可以理解為格伯利尼提及的相互交流符號?？臻g由于界定物質(zhì)的不同，是存在方向性的，繼而產(chǎn)生不同的“所指”。大理傳統(tǒng)民居是內(nèi)向型的空間，但對比兩個案例，攬清在圍合內(nèi)部院落的同時(shí)，院落與房間都朝向于洱海，外向型空間傳達(dá)的“所指”是地塊優(yōu)異的風(fēng)景條件；既下山在外圍增加了大量的開窗，框景似的朝向熙攘的街道，形成大理當(dāng)?shù)厝宋臍庀⒌乃浮?/p>

本文從新構(gòu)建的重組 Streptom yces flaveolusDS M 9954出發(fā),探討發(fā)酵條件對提高其 SFA發(fā)酵水平的影響,為 SFA工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 SFA的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料和方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

1.1.1 菌種 Streptom yces flaveolusDS M 9954,浙江大學(xué)生物工程研究所保藏。

1.1.3 種子培養(yǎng)基 (g·L-1) 甘油 40,大豆蛋白胨 10,麥芽浸膏 21,pH 7.0。

1.1.2 斜面培養(yǎng)基 (g·L-1) 可溶性淀粉 10.0,K2HPO41.0,MgSO4·7H2O 1.0,NaCl 1.0,(NH4)2SO42.0,CaCO32. 0,FeSO4·7H2O 0.001,MnCl2·7H2O 0.001,瓊脂 20,pH 7.0。

2.1 種齡和接種量對 SFA產(chǎn)量的影響 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Streptomyces flaveolusDS M 9954種齡和接種量對 SFA發(fā)酵的影響較大,結(jié)果見表 1和圖 1。種齡為 30 h的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基后發(fā)酵效價(jià)最高,為 2.01 mg·L-1。這說明適齡的種子液可以提供足夠多的、生長旺盛的種子。接種量過低,會造成發(fā)酵延遲,發(fā)酵的效率降低;而接種量過大時(shí),營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快,影響了后續(xù)次級代謝產(chǎn)物的合成,從而造成 SFA產(chǎn)量下降。從圖 1可知,6%接種量可達(dá)到最高的發(fā)酵水平。

1.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基 (g·L-1):麥芽糖 40,黃豆餅粉 40, (NH4)2SO42.0,CuSO4·5H2O 0.0587,ZnSO4·7H2O 0.5, CaCO34.0,pH 7.0。

1.3 SFA含量測定 樣品處理:將 25 mL發(fā)酵液與 25 mL乙酸乙酯混合,超聲波處理并快速均勻攪拌 20 min,4 000 rpm離心 10 min,提取上層有機(jī)相,真空旋蒸至干,加入 1 mL甲醇溶解,過濾后作液相分析。

1.2.1 菌種保藏 斜面培養(yǎng) 6～7 d,收集孢子,懸浮于 20%甘油,冷凍保存。

該模塊在設(shè)計(jì)和開發(fā)中采用了開放的、可擴(kuò)展的基于服務(wù)的軟件體系結(jié)構(gòu)，使其可以無縫集成到已有的系統(tǒng)以及新開發(fā)的系統(tǒng)當(dāng)中，為其他應(yīng)用系統(tǒng)提供預(yù)警服務(wù)。同時(shí)，采用了自適應(yīng)的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)掃描算法，當(dāng)在需要預(yù)警的時(shí)間段內(nèi)未掃描到水雨情數(shù)據(jù)時(shí)，引擎會自動縮短數(shù)據(jù)掃描時(shí)間，若在一段時(shí)間內(nèi)仍未獲取數(shù)據(jù)，才判定數(shù)據(jù)并不存在，恢復(fù)預(yù)設(shè)的掃描時(shí)間。此特性可防止因網(wǎng)絡(luò)堵塞或故障帶來的數(shù)據(jù)傳輸延遲而造成數(shù)據(jù)遺漏的情況，同時(shí)也保證了預(yù)警數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)性。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 按 4%接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,25℃培養(yǎng) 120 h,搖床轉(zhuǎn)速為 250 rpm。

應(yīng)用熱力學(xué)第一定律對循環(huán)流化床鍋爐的計(jì)算得到鍋爐各處煙氣溫度以及各換熱器出口溫度進(jìn)而應(yīng)用熱力學(xué)第二定律進(jìn)行 分析。

1.2.2 種子培養(yǎng)取 1 mL孢子懸液,接種到 250 mL種子瓶中,培養(yǎng)基裝量 25 mL,25℃培養(yǎng) 24 h,搖床轉(zhuǎn)速 250 rpm。

1.2 培養(yǎng)方法

高效液相色譜儀分析:高效液相色譜儀安捷倫 1100,色譜柱 (Agilent TC-C18,250 mm×4.6 mm,5μm),進(jìn)樣量 20 μL,檢測波長 242 nm,流速 1 mL·min-1,柱溫 25℃,流動相為A:水 (0.05%的三氟乙酸);B:乙腈 (0.05%的三氟乙酸)。梯度洗脫條件B:0～5 min 40%,5～14 min 40～60%, 14～25 min 60～70%,25～27 min 70～95%,27～30 min 95～40%。

2 結(jié)果與討論

2005—2015年，我國廢水排放量由524.50億t/年增至735.30億t/年，復(fù)合增長率達(dá)3.44%。

表 1 種齡對 SFA生產(chǎn)的影響

圖2 接種量對 SFA產(chǎn)量的影響

2.2 培養(yǎng)溫度對 SFA產(chǎn)量的影響 Streptom yces flaveolus DS M 9954的發(fā)酵對溫度非常敏感。從圖 3可知,培養(yǎng)溫度對 SFA發(fā)酵影響較大,30℃發(fā)酵時(shí),SFA產(chǎn)量達(dá)到最高 (3. 65 mg·L-1)。而當(dāng)?shù)陀诨蚋哂?30℃時(shí),產(chǎn)量急劇下降。

第一，小學(xué)語文教學(xué)中經(jīng)典誦讀時(shí)間過短。當(dāng)下由于小學(xué)語文課堂教學(xué)時(shí)間有限，教師難以保證課堂教學(xué)中經(jīng)典誦讀所占的時(shí)間比重，長此以往學(xué)生會逐漸對經(jīng)典誦讀失去學(xué)習(xí)積極性與主動性。與此同時(shí)，經(jīng)典誦讀是一個長期不間斷的學(xué)習(xí)過程，但是小學(xué)階段大部分的經(jīng)典誦讀都是由教師組織進(jìn)行的，很難保證經(jīng)典誦讀的連貫性與持續(xù)性，致使課堂教學(xué)效果與教學(xué)效率較低。

圖3 溫度對 SFA發(fā)酵的影響

2.3 發(fā)酵液初始 pH值對 SFA產(chǎn)量的影響 培養(yǎng)基酸堿性也是影響微生物次級代謝的關(guān)鍵因素。從表 2可知,培養(yǎng)基初始 pH值 6.5時(shí),產(chǎn)量達(dá)到 4.11 mg·L-1。一方面,這可能是因?yàn)榕c SFA合成的關(guān)鍵酶在中性偏酸性條件下表現(xiàn)出最大活性,另一方面,SFA分子含有酚羥基 (圖 1),中性偏酸性條件更有利于 SFA分子呈電中性,減少了細(xì)胞膜對 SFA的電荷效應(yīng),有利于 SFA的胞外分泌。

表2 發(fā)酵液初始pH值對 SFA發(fā)酵的影響

2.4 搖床轉(zhuǎn)速及搖瓶裝液量對 SFA產(chǎn)量的影響 液體培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的傳質(zhì)效應(yīng)會直接影響 SFA發(fā)酵產(chǎn)物的積累。本文以搖床轉(zhuǎn)速和搖瓶裝液量為考察對象,分析了傳質(zhì)對 SFA發(fā)酵的影響。Streptom yces flaveolus的 SFA發(fā)酵過程對氧氣和營養(yǎng)傳遞要求較高。結(jié)果如圖 4、5所示。搖床轉(zhuǎn)速為 100 rpm時(shí),SFA產(chǎn)量幾乎為零,這表明低轉(zhuǎn)速可能不利于培養(yǎng)基中氣體傳質(zhì),缺氧導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡,二氧化碳的積累也會使 SFA合成酶活性降低;但過高的轉(zhuǎn)速有可能破壞鏈霉菌的菌絲體結(jié)構(gòu),降低鏈霉菌生產(chǎn) SFA的能力。當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到 350 rpm時(shí),SFA產(chǎn)量急劇下降。裝液量對 SFA發(fā)酵的影響也很大。裝液量過低造成水分揮發(fā),影響發(fā)酵體系的滲透壓;而過高的裝液量影響了氧的傳質(zhì),也容易導(dǎo)致菌體成團(tuán),不利于營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣傳遞。搖床轉(zhuǎn)速及搖瓶裝液量對發(fā)酵產(chǎn)物影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了營養(yǎng)物和氧氣的傳質(zhì)對 SFA等次級代謝產(chǎn)物積累的影響是非常明顯的。這是發(fā)酵規(guī)模放大時(shí)需要重點(diǎn)考慮的要素之一。

2.5 SFA發(fā)酵進(jìn)程 次級代謝產(chǎn)物是微生物發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期后期和衰亡期才產(chǎn)生的、非菌體生長和繁殖必需的物質(zhì)。在發(fā)酵過程中次級代謝產(chǎn)物會經(jīng)歷產(chǎn)量逐漸增長、穩(wěn)定和分解三個階段。在菌齡、接種量、發(fā)酵溫度、pH值、轉(zhuǎn)速和裝液量等發(fā)酵因素處于最佳值的情況下,考察 Streptomyces flaveo-l u s D S M9 9 5 4在發(fā)酵進(jìn)程中,生物量和SFA產(chǎn)量變化。結(jié)果如圖 6所示,在 72 h前,鏈霉菌的 SFA產(chǎn)量很低,在 108 h時(shí)菌體生長進(jìn)入衰亡期,SFA產(chǎn)量達(dá)到最高值 6.12 mg·L-1。適當(dāng)延長衰亡期將有利于進(jìn)一步提高 SFA發(fā)酵產(chǎn)量。我們還發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液的顏色會隨著發(fā)酵時(shí)期而變化,從第三天開始由灰色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色,衰亡期伴隨著各種色素產(chǎn)生。從色素的變化可以間接反映 SFA的產(chǎn)生和產(chǎn)量。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對 SFA生產(chǎn)的影響

圖5 裝液量對 SFA發(fā)酵的影響

圖 6 SFA產(chǎn)量和細(xì)胞生長曲線

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),Streptom yces flaveolus發(fā)酵產(chǎn)生 SFA的過程對發(fā)酵條件非常敏感。這可能是很多關(guān)于 SFA發(fā)酵報(bào)道的產(chǎn)量偏低的重要原因。本文針對種齡、接種量、溫度、pH、搖床轉(zhuǎn)速和裝液量等發(fā)酵重要參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。經(jīng)過條件優(yōu)化,得到最佳發(fā)酵工藝:種齡 24 h、接種量 6%(v/v)、培養(yǎng)溫度 30℃、發(fā)酵液初始 pH 6.5、搖床轉(zhuǎn)速 300 rpm和裝液量 25 mL/250 mL搖瓶。在最佳的搖瓶發(fā)酵條件下,SFA產(chǎn)量在發(fā)酵 108 h時(shí),達(dá)到 6.12 mg·L-1,這是發(fā)酵條件優(yōu)化前 (2.01 mg·L-1)3倍多。比其他報(bào)道的 SFA發(fā)酵水平都有明顯的提高。當(dāng)然,進(jìn)一步擴(kuò)大 SFA發(fā)酵規(guī)模,尤其是利用發(fā)酵罐深層培養(yǎng)將可能進(jìn)一步提高 SFA的發(fā)酵水平。這些工作為推動 SFA大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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