劉 斐，吳補(bǔ)領(lǐng)，高 杰，黃 欣，麻丹丹，陳 婷

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔科·南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510515)

血清饑餓法對(duì)人牙髓細(xì)胞周期同步化的研究

劉 斐，吳補(bǔ)領(lǐng)，高 杰，黃 欣，麻丹丹，陳 婷

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔科·南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510515)

目的:探討不同的血清饑餓方法和饑餓時(shí)間對(duì)人牙髓細(xì)胞(HDPCs)細(xì)胞周期的影響。方法:血清直接饑餓和梯度饑餓處理人牙髓細(xì)胞。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);CCK－8檢測(cè)血清饑餓處理對(duì)HDPCs增殖能力的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期驗(yàn)證HDPCs同步化的效果。結(jié)果:血清直接饑餓處理或梯度饑餓處理后其G0/G1期HDPCs的比例均顯著高于一般培養(yǎng)組(P＜0.05)，但血清直接饑餓組和梯度饑餓組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。用含5 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h能獲得較滿意的結(jié)果，G0/G1期細(xì)胞百分比達(dá)85.95%。結(jié)論:血清饑餓法能有效地使人牙髓細(xì)胞同步于G0/G1期;5 mL/L FBS血清饑餓處理細(xì)胞48 h可取得較好的細(xì)胞周期同步化效果。

血清饑餓法;人牙髓細(xì)胞;細(xì)胞周期同步化;G0/G1期

［牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2011，21(2):67］

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2011，21(2):67］

隨著對(duì)損傷牙髓組織修復(fù)性研究的日益深入，大多數(shù)的藥物實(shí)驗(yàn)要求在誘導(dǎo)前保持細(xì)胞周期的同步性，以得到一個(gè)更為客觀真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。血清饑餓法是一種對(duì)細(xì)胞干擾較小，較少影響細(xì)胞周期發(fā)育進(jìn)程并能夠?qū)⒓?xì)胞周期停滯于G0/G1期的同步化方法［1－2］。目前，尚無(wú)關(guān)于 HDPCs成熟有效的血清饑餓同步化方法的報(bào)道。本研究旨在尋找對(duì)HDPCs實(shí)施血清饑餓同步化方法的最佳條件，從而為研究HDPCs增殖周期及牙髓組織損傷修復(fù)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

胰蛋白酶、胎牛血清FBS、DMEM(Gibco公司，美國(guó));CCK－8(同仁公司，日本);流式細(xì)胞儀、PI細(xì)胞周期流式檢測(cè)試劑盒、倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

取因正畸需要新鮮拔除的年輕健康者前磨牙，無(wú)菌條件下劈冠取出牙髓，用PBS液反復(fù)沖洗，組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)(培養(yǎng)液為含有100 mL/L FBS、青霉素 100 U/mL、鏈霉素 100 U/mL的DMEM培養(yǎng)基，pH=7.2)，每2～3d換液。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底后用2.5g/L胰蛋白酶(含EDTA)消化后1∶3傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察HDPCs的生長(zhǎng)情況和形態(tài)特征，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志物 CD105、CD29、CD34、CD33、CD45 的表達(dá)情況。

1.2.2 血清饑餓處理的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將3～5代HDPCs細(xì)胞接種于6孔板上，待細(xì)胞達(dá)到 80%匯合，加入含不同濃度(0、5、100 mL/L)血清的DMEM培養(yǎng)基處理細(xì)胞，分別與處理后不同時(shí)間(0、24、48、72 h)在倒置顯微鏡下調(diào)整視野，觀察不同時(shí)間段細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.3 CCK－8 法檢測(cè)細(xì)胞生物活性

將消化所得的3～5代HDPCs以1.0×104/孔密度接種于96孔板，每孔體積100 μL，復(fù)孔4個(gè)，隔天換液。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%匯合后，PBS沖洗3遍，分別加入含 0、1、3、5、100 mL/L FBS 的dMEM培養(yǎng)基，分別于培養(yǎng) 12、24、48、72、96 h 時(shí)每孔依次加入10 μL CCK－8 溶液，37 ℃孵育 2 h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定(波長(zhǎng)490 nm)每孔的吸光度值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期

取第3～5代HDPCs以7.0×104/孔密度接種于6孔板上，每孔培養(yǎng)液2 mL，復(fù)孔4個(gè)，隔天換液。待細(xì)胞匯合至80%后，PBS洗3遍，加入含0、5、100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)0、24、48、72 h后同時(shí)將饑餓48 h后的細(xì)胞去原培養(yǎng)液，換含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液再正常培養(yǎng)24 h。然后將各組細(xì)胞用PBS沖洗2遍，離心(4 ℃、1 000 r/min，5 min)，加入 500 μL PBS 將細(xì)胞重懸，注入預(yù)冷的700 mL/L的乙醇2 mL 4℃過(guò)夜固定，上機(jī)前再次離心(800 r/min，6 min)，棄乙醇固定液，冷 PBS洗，5%PI染液0.5 mL，4 ℃孵育30 min上機(jī)檢測(cè)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組數(shù)據(jù)間的比較采用方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 原代細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和表面標(biāo)志物鑒定

培養(yǎng)第5天時(shí)可在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞從組織塊中游走，呈放射性生長(zhǎng)，1周后形成生長(zhǎng)暈。成纖維樣細(xì)胞形態(tài)為主，呈星形或長(zhǎng)梭形，胞漿豐富，細(xì)胞核橢圓居中，核仁清晰可見(jiàn)。14d時(shí)相鄰組織塊的細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)匯合，傳代后的牙髓細(xì)胞經(jīng)過(guò)連續(xù)培養(yǎng)呈復(fù)層生長(zhǎng)特性。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示CD105、CD29呈(+)表達(dá)，表達(dá)率分別為97.67%、98.33%;CD34、CD33、CD45 呈(－ )表達(dá)，表達(dá)率分別為 0.13%、0.31%、0.33%。證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為間葉組織來(lái)源。

2.2 血清饑餓處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析(圖1)

由圖1可見(jiàn)，鏡下觀察血清饑餓法對(duì)細(xì)胞周期同步化處理初期(24、48 h)并未對(duì)細(xì)胞的形態(tài)產(chǎn)生明顯影響，但隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)(72 h)，逐漸出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，形態(tài)發(fā)生改變，大部分細(xì)胞變圓，極性消失，細(xì)胞間出現(xiàn)碎片增多，細(xì)胞凋亡以及失去貼壁，脫落壞死的情況。其中血清饑餓兩濃度組在各時(shí)間觀察點(diǎn)并未見(jiàn)明顯差異，但與正常培養(yǎng)組(100 mL/L FBS)相比有顯著差異性。

圖1 不同濃度FBS處理HDPCs不同時(shí)間的形態(tài)學(xué)圖譜(×100)

2.3 CCK－8 檢測(cè)結(jié)果(圖2)

由圖2可見(jiàn)，應(yīng)用CCK－8檢測(cè)梯度血清饑餓和正常培養(yǎng)對(duì)HDPCs生長(zhǎng)情況的影響，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，饑餓時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)至12 h時(shí)，各組細(xì)胞均有少量增殖，且無(wú)血清組和梯度饑餓組先緩慢增加，并較正常培養(yǎng)組稍高。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)至24 h時(shí)，無(wú)血清組和梯度饑餓組OD值開(kāi)始平穩(wěn)下降，組間差異不明顯(P＞0.05)，但較正常培養(yǎng)組相比，有顯著性差異(P＜0.05)。

2.4 細(xì)胞周期分析(圖3，表1)

如圖3和表1所示，血清饑餓組的G0/G1期HDPCs均高于正常培養(yǎng)組。與正常培養(yǎng)組相比5 mL/L FBS饑餓24 h后，大多數(shù)的HDPCs的細(xì)胞周期停止于G0/G1期，S期和G2/M期比例下降(P＜0.05)。處理48 h時(shí)G0/G1的比例為85.95%，與正常培養(yǎng)組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，G0/G1的比例下降，饑餓48 h后再恢復(fù)FBS正常培養(yǎng)的細(xì)胞G0/G1的比例與正常培養(yǎng)組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 不同濃度FBS處理HDPCs不同時(shí)間的細(xì)胞活力分析

圖3 48 h時(shí)各個(gè)濃度的血清對(duì)細(xì)胞周期影響的流式分析

表1 HDPCs血清饑餓不同時(shí)間的細(xì)胞周期分析表(n=3，±s)

表1 HDPCs血清饑餓不同時(shí)間的細(xì)胞周期分析表(n=3，±s)

*與正常培養(yǎng)組相比P＜0.05

細(xì)胞周期 正常培養(yǎng) 5 mL/L FBS饑餓處理(h)24 hg0/G1 71.06 ±1.2 77.1 ±0.9* 85.95 ±1.4* 81.6 ±2.1*24 48 72 恢復(fù)FBS培養(yǎng)2.63 ±1.1 79.85 ±0.8 S 13.76 ±0.6 4.5 ±0.4* 3.39 ±0.5* 6.5 ±1.5 7.51 ±0.4g2/M 15.18 ±0.7 18.3 ±0.8 10.67 ±0.9 11.8 ±1.3 1

3 討論

細(xì)胞的分裂周期分為G1期、S期、G2期和M期，在分裂的最末時(shí)相時(shí)細(xì)胞將選擇進(jìn)入G0期或者新的細(xì)胞周期。正常情況下，大多數(shù)的HDPCs處于分裂的G0期，在受到損傷刺激時(shí)才進(jìn)入新的細(xì)胞周期。本研究采用血清饑餓法建立了HDPCs同步化于G0/G1期的方法，在短期內(nèi)獲得大量可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的G0/G1期細(xì)胞，并將G0/G1期細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的比例控制在可接受的范圍內(nèi)。一般來(lái)講，血清饑餓法所采用的胎牛血清濃度一般為0～5 mL/L。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們通過(guò)形態(tài)觀察和CCK－8法篩選出5 mL/L FBS饑餓處理的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)和細(xì)胞增殖活力比較中與對(duì)照組最為相近。其中在CCK－8法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線時(shí)發(fā)現(xiàn)在饑餓誘導(dǎo)的初期(12 h)，梯度饑餓組的OD值較對(duì)照組稍高，我們猜測(cè)其原因可能為細(xì)胞對(duì)外界刺激的預(yù)適應(yīng)反應(yīng)，為一種代償性反應(yīng)表現(xiàn)。而對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的HDPCs進(jìn)行流式細(xì)胞周期分析后發(fā)現(xiàn)饑餓處理48 h后的同步化效果最佳，G0/G1期的同步化達(dá)到85.95%，較對(duì)照組71.06%相比有明顯提高。而且在恢復(fù)正常培養(yǎng)24 h后G0/G1期比率與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。

當(dāng)血清濃度較低時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)因缺乏足夠的血清生長(zhǎng)因子而處于饑餓狀態(tài)，抑制了細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK2、CDK4的表達(dá)，大量原處于S和G2/M期的細(xì)胞分別進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞周期停滯于G0/G1期［3－5］。對(duì)于大多數(shù)的細(xì)胞而言，血清饑餓的時(shí)間一般在兩個(gè)細(xì)胞倍增時(shí)間之內(nèi)，太短太長(zhǎng)都不能達(dá)到理想的同步化效果。在本實(shí)驗(yàn)中，5 mL/L FBS饑餓處理48 h和72 h后的細(xì)胞同步率較處理48 h低，其中處理72 h組的壞死和凋亡細(xì)胞的比例也較48 h高。由此證明進(jìn)一步延長(zhǎng)饑餓時(shí)間不僅不能有效的增高細(xì)胞的同步率，細(xì)胞還會(huì)因?yàn)槿狈I(yíng)養(yǎng)而受到損傷，核內(nèi)DNA碎片增多［6］，引起細(xì)胞的凋亡［7］，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。所以在血清饑餓時(shí)必需考慮的因素有細(xì)胞的特性，血清的濃度以及同步化的時(shí)間。此外有文獻(xiàn)證明細(xì)胞的傳代次數(shù)，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)以及融合率都會(huì)對(duì)細(xì)胞周期的分布產(chǎn)生影響［8］。

目前用于細(xì)胞周期同步化的方法有很多種，如溫度休克、血清饑餓、照射、胰酶消化、藥物抑制、機(jī)械振動(dòng)收集分裂細(xì)胞［9－11］等等。最常用的是匯合培養(yǎng)，藥物阻滯和血清饑餓法［12］，而對(duì)損傷或正常的牙髓組織進(jìn)行藥物誘導(dǎo)篩選實(shí)驗(yàn)時(shí)最好采用血清饑餓法，以防止藥物之間的干擾對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

綜上所述，血清饑餓法能有效的對(duì)人牙髓細(xì)胞進(jìn)行周期同步化，本實(shí)驗(yàn)所選用的5種不同濃度的胎牛血清培養(yǎng)基在細(xì)胞周期同步化能力方面有一定的差異，其中以5 mL/L FBS培養(yǎng)48 h為最佳，可以較好的使大多數(shù)的HDPCs進(jìn)行細(xì)胞周期同步化，并控制實(shí)驗(yàn)過(guò)程中壞死、凋亡細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，為將來(lái)進(jìn)一步進(jìn)行體外研究外源性刺激對(duì)牙髓組織的影響及其作用機(jī)制提供更多的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Effects of serum starvation on cell cycle synchronization in humandental pulp cells

LIU Fei，WU Bu－ling，GAO Jie，HUANG Xin，MAdan－dan，CHEN Ting
(Department of Stomatology，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China)

AIM:To examine the effects of serum starvation on cell cycle synchronization of humandental pulp cells(HDPCs)by treating HDPCs withdifferent starvation methods and starvation times.METHODS:HDPCs were treated with serumdirect starvation andgradient starvation.The morphological changes of HDPCs were observed by an inverted microscope.CCK－8 assay was used to investigate the effects of serum starvation on cell proliferation，and cell cycledistribution of HDPCs wasdetected by flow cytometry(FCM).RESULTS:HDPCgrowth was significantly inhibited by serum starvation.Treatment of HDPCs with serumdirect starvation orgradient starvation resulted in a significant increase of cells arrested atg0/G1 stage in comparision with the controlgroup(P ＜0.05)，but there was no significantdifference between the serumdirect starvation andgradient starvationgroups.HDPCs cultured indMEM containing 5 mL/L fetal bovine serum(FBS)for 48h showed the most satisfactory result，with 85.95%of HDPCs atg0/G1 phase.CONCLUSION:Serum starvation can efficiently arrest HDPCs atg0/G1 stage，and the optimum result can be achieved with 0.5%FBS serum and a culture period of 48h.

serum starvation;HDPCs;synchronization of the cell cycle;G0/G1 stage

R780.2

A

1005－2593(2011)02－0067－05

2010－11－23

教育部博士點(diǎn)新教師基金項(xiàng)目(20094433120004)廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008B011300018－8)

劉斐(1986～)，女，漢族，湖南岳陽(yáng)人。碩士生(導(dǎo)師:吳補(bǔ)領(lǐng))

吳補(bǔ)領(lǐng)，E －mail:bulingwu@yahoo.com.cn