李長于，李祖光，周示玉，葉丹鳳，劉文涵

（1.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測研究院，浙江 杭州 310013）

氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定香精香料中的香豆素和黃樟素

李長于1，2，李祖光1，周示玉1，葉丹鳳1，劉文涵1

（1.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測研究院，浙江 杭州 310013）

采用乙醇超聲提取，丙酸苯乙酯為內(nèi)標(biāo)進行定量，氣相色譜－離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法測定香精香料中香豆素和黃樟素的含量。選取香豆素的母離子和子離子分別為m/z146和m/z118，黃樟素的母離子和子離子分別為m/z162和m/z131，內(nèi)標(biāo)丙酸苯乙酯選擇m/z104為定量離子。結(jié)果表明，香豆素和黃樟素在0.05～5mg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r＞0.995），方法的檢測限（S/N＝3）香豆素為0.004mg/L、黃樟素為0.002 mg/L，加標(biāo)回收率為90.0%～131.2%。該方法操作簡單、快速、靈敏度高，適用于香精香料中香豆素和黃樟素的快速檢測。

香豆素；黃樟素；香精香料；氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）

香豆素（coumarin）又名鄰羥基桂酸內(nèi)酯和1，2-苯并吡喃酮，是廣泛存在于自然界中的一種內(nèi)酯類化合物，在蕓香科和傘形科植物中存在最多，其次存在于豆科、蘭科、木樨科、茄科和菊科植物，少數(shù)來自微生物［1］。毒理實驗發(fā)現(xiàn)，香豆素對小鼠胚胎有毒性，能引起痛覺消失，使中性膽堿醋酶發(fā)生變化，對大鼠為可疑致腫瘤物。歐盟規(guī)定，對于洗去型化妝品，香豆素含量不得超過30μg/g，對于非洗去型化妝品，香豆素含量不得高于10μg/g［2］。黃樟素（safrole）又稱黃樟油素、黃樟腦，它主要存在于沉水樟、堅葉樟等樟屬植物的精油中［3］。黃樟素是合成洋茉莉醛、香蘭素、胡椒基丙酮及胡椒基丁醚等香料化學(xué)品的一種重要原料，同時黃樟油中含黃樟素，是一種天然香精，曾用于食品添加劑和化妝品中。但近年來有研究表明，黃樟素能在肝組織中形成黃樟素－脫氧核糖核酸（DNA）加合物，對人體有一定的毒副作用，易誘發(fā)基因突變和肝損傷，甚至肝癌，是消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)的強致癌物［4］。因此，目前世界各國均禁止將黃樟素作為香料和食品添加劑直接使用。在香精香料生產(chǎn)過程中有可能由天然植物精油帶入香豆素和黃樟素成分，因此對香精香料進行質(zhì)量控制是非常必要的。

目前，關(guān)于香豆素和黃樟素的測定方法有液相色 譜［5－10］、氣 相 色 譜 和 氣 相 色 譜－質(zhì) 譜 聯(lián) 用法［11－17］。串聯(lián)質(zhì)譜能夠提供足夠的化合物結(jié)構(gòu)信息，可用于定性分析及推測化合物結(jié)構(gòu)［18］，準(zhǔn)確可靠，特征母離子和子離子的一一對應(yīng)性使之排除干擾能力強，定量時本底值低，檢測靈敏度高，特別適用于分析背景干擾嚴(yán)重、定性困難、被測化合物含量很低的樣品，該技術(shù)在食品有機污染物檢測方面［19－23］已得到應(yīng)用。對于香精香料中的香豆素和黃樟素，國內(nèi)外還未見利用氣相色譜－離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法進行檢測的報道。本研究采用氣相色譜－離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法檢測香精香料中的香豆素和黃樟素，并對目前市場上使用的各種香精香料樣品進行分析檢測。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置

CP 3800-Saturn 2000氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Varian公司產(chǎn)品，配有液體化學(xué)源（CI，色譜級乙腈為化學(xué)電離反應(yīng)試劑）。

1.2 主要材料與試劑

香豆素、黃樟素和丙酸苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99.9%）：迪馬公司產(chǎn)品；乙醇（分析純）：杭州化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；市售的各種香精香料樣品。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

香豆素和黃樟素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.01g香豆素和0.01g黃樟素于100mL容量瓶中，用乙醇稀釋定容至刻度，配制成100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用乙醇溶液分別稀釋至10mg/L，搖勻，置于4℃冰箱儲存，備用。

丙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.01g丙酸苯乙酯于100mL容量瓶中，用乙醇稀釋定容至刻度，配制成100mg/L丙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)溶液，然后用乙醇分別稀釋至10mg/L和1 mg/L，搖勻，置于4℃冰箱儲存，備用。

不同濃度的香豆素和黃樟素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用乙醇溶液將10mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋成以下濃度：5.0、2.0、1.0、0.5、0.1、0.05mg/L，每級標(biāo)液中內(nèi)標(biāo)丙酸苯乙酯濃度均為1mg/L。

1.4 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取0.2g香精香料樣品于50mL錐形瓶中，加入3g無水Na2SO4除水，然后加入10mL含內(nèi)標(biāo)（丙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)濃度為1mg/L）的乙醇溶液，超聲20min，靜置；然后將錐形瓶中的提取液全部轉(zhuǎn)入10mL容量瓶中，并用乙醇清洗錐形瓶3次，清洗液也轉(zhuǎn)入容量瓶中，定容至刻度，超聲均勻后靜置過夜。取1μL上層清液進行GC-MS/MS分析。

1.5 試驗條件

1.5.1 色譜條件 毛細管色譜柱：DB-5low bleed/MS，30m×0.25mm×0.25μm（J＆W Scientific，CA，USA）；進樣口溫度：250 ℃；載氣：He，純度99.999%，流速1.0mL/min；程序升溫：柱溫100℃，保持1min，以3℃/min升至160℃，然后以20℃/min升至280℃，保持5 min；進樣量1.0μL；不分流進樣。

1.5.2 質(zhì)譜條件 采用電子轟擊方式進行離子化，EI電離能量70eV，離子阱溫度150℃，歧管溫度40℃，傳輸線溫度250℃，溶劑延遲時間8 min。香豆素母離子為m/z146，子離子為m/z118，碰撞電壓（CID）0.50V；黃樟素母離子為m/z162，子離子為m/z131，碰撞電壓0.78V；CID模式均采用共振模式；內(nèi)標(biāo)物丙酸苯乙酯選擇m/z104為定量離子。

2 結(jié)果與討論

2.1 串聯(lián)質(zhì)譜條件的優(yōu)化

吸取1μL濃度為5.0mg/L香豆素和黃樟素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣，在電子轟擊電離方式下進行全掃描，對二級質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，得到香豆素和黃樟素的EI-MS質(zhì)譜圖，分別示于圖1和圖2。

圖1 香豆素的EI-MS質(zhì)譜圖Fig.1 EI-MS spectra of coumarin

圖2 黃樟素的EI-MS質(zhì)譜圖Fig.2 EI-MS spectra of safrole

MS/MS分析中對子離子譜影響最大的是碰撞電壓，如果碰撞電壓太高，母離子完全碎裂；如果碰撞電壓太低，母離子沒有碎裂或子離子碎片過少，化合物的結(jié)構(gòu)信息不足。試驗對選定的母離子逐漸加大碰撞電壓，比較不同碰撞電壓的MS/MS圖譜，選擇最佳的碰撞電壓和其他分析條件，以便得到盡可能豐富的結(jié)構(gòu)信息。選擇合適的母離子和子離子是保證目標(biāo)化合物獲得最佳靈敏度的重要因素，通常從目標(biāo)化合物的一級質(zhì)譜中選擇響應(yīng)較大的特征離子作為母離子，可得到更高的靈敏度，所以本研究以香豆素分子離子m/z146和黃樟素分子離子m/z162作為母離子進行AMD（Automated Methods Development），確定合適的碰撞電壓，實驗結(jié)果列于表1和表2。

表1 碰撞電壓對香豆素MS/MS譜圖的影響Table 1 Effect of value of CID on MS/MS spectra of coumarin

表2 碰撞電壓對黃樟素MS/MS譜圖的影響Table 2 Effect of value of CID on MS/MS spectra of safrole

由表1可知，當(dāng)碰撞電壓小于0.40V時，香豆素母離子有少量碎裂；當(dāng)碰撞電壓逐漸上升，母離子的豐度逐漸下降，子離子的豐度上升；當(dāng)碰撞電壓為0.46～0.50V時，母離子已大部分碎裂；直到碰撞電壓為0.60V時，母離子完全碎裂，m/z146母離子消失。因此本試驗選擇香豆素最佳碰撞電壓為0.50V，香豆素的 EI-MS/MS分析結(jié)果示于圖3。同理，由表2可知，當(dāng)碰撞電壓小于0.60V時，黃樟素母離子有少量碎裂；當(dāng)碰撞電壓逐漸上升，母離子的豐度逐漸下降，子離子的豐度上升；當(dāng)碰撞電壓為0.72～0.78V時，母離子已大部分碎裂；直到碰撞電壓為0.80V時，母離子完全碎裂，m/z162母離子消失。因此本試驗選擇黃樟素最佳的碰撞電壓為0.78V，黃樟素的EI-MS/MS分析結(jié)果示于圖4。

圖3 香豆素的EI-MS/MS質(zhì)譜圖Fig.3 EI-MS/MS spectra of coumarin

圖4 黃樟素的EI-MS/MS質(zhì)譜圖Fig.4 EI-MS/MS spectra of safrole

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)香豆素和黃樟素的二級質(zhì)譜圖，選取香豆素最高峰強度子離子m/z118、黃樟素最高峰強度子離子m/z131作為定量離子；內(nèi)標(biāo)丙酸苯乙酯m/z104為定量離子。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液中香豆素、黃樟素分別與丙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（y）和濃度的比值（x）作圖，示于圖5和圖6。結(jié)果顯示，香豆素和黃樟素的標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.05～5mg/L范圍內(nèi)，所得峰面積比與濃度比的線性關(guān)系均較良好，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：y＝0.492 1x＋0.040 1，r＝0.998和y＝0.387 7x＋0.011 5，r＝0.999。

圖5 香豆素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of coumarin

圖6 黃樟素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of safrole

2.3 精密度試驗及檢測限

將濃度為0.1mg/L香豆素和黃樟素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進樣7次，經(jīng)測定計算得到香豆素和黃樟素的RSD值分別為3.18%和2.84%。檢測限（LOD）的計算是根據(jù)進樣0.05mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在信噪比（S/N）為3的條件下，計算得到香豆素和黃樟素的檢測限分別為0.004、0.002mg/L。

2.4 回收率試驗結(jié)果

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進行回收率試驗，對方法的準(zhǔn)確度進行考察。在空白香精香料樣品中，按高、中、低3個水平分別加入1.0，0.5，0.2mL 10 mg/L香豆素和黃樟素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度水平進行5次平行試驗，結(jié)果列于表3。

表3 回收率試驗結(jié)果（n＝5）Table 3 Recovery rate of coumarin and safrole at different spiked amounts（n＝5）

計算結(jié)果顯示，香豆素和黃樟素在不同添加量樣品中的平均回收率分別為109.5%～131.2%和90.0%～95.8%。

2.5 實際樣品檢測

按試驗方法對市售的100多個香精香料樣品進行分析，大部分樣品中均未檢出香豆素和黃樟素，只有極少數(shù)樣品中檢出香豆素或黃樟素，其中5種市售香精香料樣品的檢測結(jié)果列于表4。根據(jù)香豆素和黃樟素的色譜保留時間以及其特征質(zhì)譜圖，對檢出香豆素或黃樟素的樣品進行了定性確認(rèn)，選擇香豆素特征離子m/z118、m/z146，黃樟素特征離子m/z131、m/z104為定性離子，樣品的色譜保留時間和質(zhì)譜碎片離子必須與標(biāo)準(zhǔn)品完全吻合。

表4 采用本方法測得的香精香料中香豆素和黃樟素的含量Table 4 Contents of coumarin and safrole in flavor analyzed by this method

3 結(jié)論

本研究建立了香精香料樣品中香豆素和黃樟素的氣相色譜－離子阱串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品只需乙醇超聲處理，就可以直接進樣，前處理步驟簡單，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜排除干擾能力強，定量時本底值低的特性，該方法具有快速簡便、檢測靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)好，適合于香精香料或食品添加劑等復(fù)雜樣品中的香豆素和黃樟素的檢測，同時也為其他復(fù)雜樣品中香豆素和黃樟素含量的測定提供了可借鑒的方法。

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Determination of Coumarin and Safrole in Flavor by Gas Chromatography Coupled to Ion Trap Tandem Mass Spectrometry

LI Chang－yu1，2，LI Zu-guang1，ZHOU Shi-yu1，YE Dan-feng1，LIU Wen-han1
（1.College of Chemical Engineering and Materials Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou310014，China；2.Zhejian Test Academy of Quality and Technical Supervision，Hangzhou310013，China）

A method for determination of coumarin and safrole in flavor was developed by gas chromatography coupled to ion trap tandem mass spectrometry（GC-MS/MS）.Sample was ultrasonically extracted with ethanol from the flavor.The analysis was performed by GC-MS/MS using propanoic acid，2-phenylethyl ester as an internal standard.Them/z146 andm/z118were selected as the parent ion and daughter ion for coumarin，them/z162andm/z131as the parent ion and daughter ion for safrole，respectively.Them/z104was selected as the quantitation ion for propanoic acid，2-phenylethyl ester as an internal standard.Results show that，when the concentration of coumarin and safrole compounds ranged of 0.05－5mg/L，the curves show good linear relationship（r＞0.995）.The lowest detection limit of the method（S/N＝3）are 0.004mg/L，0.002mg/L for coumarin and safrole，re-spectively.The recoveries ranged from 90.0%to 131.2%.The method is simple，rapid，high sensitivity，and suitable for the determination of coumarin and safrole in flavor.

coumarin；safrole；flavor；gas chromatography-tandem mass spectrometry（GCMS/MS）

O 657.63

A

1004-2997（2011）05-0265-06

2011-02-15；

2011-05-16

浙江省自然科學(xué)基金項目（Y407308）和浙江省科技廳錢江人才項目（2010R10044）資助

李長于（1983～），男，江西婺源人，碩士研究生，從事分析化學(xué)研究工作。E-mail：lcy0610mail＠126.com

李祖光（1971～），男，江西上饒人，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事分析化學(xué)等教學(xué)和科研工作。E-mail：lzg＠zjut.edu.cn