郭 丹,孫藜瑋

(煙臺職業(yè)學(xué)院,山東 煙臺 264670)

0 引言

類胡蘿卜素是一類具有特殊功能的天然色素的總稱,廣泛存在于自然界的動物、植物、真菌、藻類和細(xì)菌中。類胡蘿卜素的抗氧化作用,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于維生素E和維生素C,成為受國際藥物、膳食補(bǔ)充劑、功能食品界等廣泛關(guān)注的新型抗氧化活性物質(zhì),被譽(yù)為21世紀(jì)抗氧化劑時(shí)代的“新貴”[1]。

目前提取類胡蘿卜素的途徑很多,其中最常用的有兩種:一是用培養(yǎng)鹽藻來提取類胡蘿卜素,這種方法需要在高鹽份的海域環(huán)境,所以只能在少數(shù)地區(qū)養(yǎng)殖,生產(chǎn)的局限性很大,不宜大范圍推廣;二是用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素,目前能夠發(fā)酵產(chǎn)生類胡蘿卜素的微生物主要有真菌、細(xì)菌和酵母菌等[2-3]。

光合細(xì)菌(Photosynthetic bacteria)是生產(chǎn)類胡蘿卜素的主要微生物,因其生產(chǎn)周期短,不受季節(jié)限制,而且菌體含有豐富的蛋白質(zhì),色素提取后的殘留物可用作餌料、飼料等而備受科學(xué)工作者的重視。為了便于光合細(xì)菌中類胡蘿卜素的大規(guī)模開發(fā)和利用,本文將對光合細(xì)菌的生長條件及所得類胡蘿卜素制品的性質(zhì)進(jìn)行研究[4-5]。

1 培養(yǎng)基的配制[6]

1.1 RCVBN培養(yǎng)基(固體/液體):

無機(jī)鹽溶液 10%

微量元素溶液 0.1%

生長因子溶液 0.1%

20%DL-蘋果酸溶液 2%

20%(NH4)2SO4溶液 0.5%

磷酸緩沖液 1.5%

p H 6.8

121℃滅菌 20分鐘

(1)無機(jī)鹽溶液(1000m l)

M gSO4·7H2O 2.0g

CaCl2·2H2O 0.75g

FeSO4·7H2O 0.12g

EDTA 0.2g

p H 6.8

(2)微量元素溶液(250m l)

H3BO30.7g

M nSO4·H2O 0.398g

NaMoO40.188g

ZnSO4·7H2O 0.06g

Ca(NO3)2·3H2O 0.01g

p H 6.8

(3)磷酸緩沖液(1000 m l)

KH2PO440g;

K2HPO460g。

(4)生長因子溶液(100m l)

生物素 1.5mg;

鹽酸硫胺素 100mg;

尼克酸 100mg;

對氨基苯甲酸 100mg;

p H 6.8。

(5)20%DL-蘋果酸溶液(100m l)

20g DL-蘋果酸,用約1/3體積12N NaOH調(diào)至p H值6.8。

(6)20%(N H4)2SO4溶液(100m l)

20g的(N H4)2SO4溶液以12N NaOH調(diào)至p H值6.8。

1.2 乙酸鈉乙酸銨培養(yǎng)基

無機(jī)鹽溶液10%,微量元素溶液0.1%,生長因子溶液0.1%,磷酸緩沖液1.5%(以上溶液的配制同RCVBN培養(yǎng)基),乙酸鈉1g,乙酸銨1g,蒸餾水1L,p H=6.8,121℃滅菌20min。

1.3 乙酸鹽培養(yǎng)基

乙酸鈉2g,KH2PO40.5g,K2HPO40.5g,M gSO4·7H2O 0.2g,CaCl20.14g,NH4Cl 0.8g,NaCl 0.1g,酵母膏0.5g,水1L,p H=7.0,121℃滅菌20min。

1.4 YP培養(yǎng)基

蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl 5g,p H=6.8,121℃滅菌20m in。

2 菌種培養(yǎng)

2.1 菌種活化

取冰箱冷藏菌種在 YP培養(yǎng)基平板上劃線,25-28℃,800lx白熾燈光照培養(yǎng)48小時(shí)。

2.2 分離純化

在YP培養(yǎng)基平板上去紅色單菌落重新劃線,直至得到純培養(yǎng)。

2.3 液體種子培養(yǎng)

用RCVBN培養(yǎng)基洗下斜面上的菌苔,液體培養(yǎng)3天。

2.4 液體擴(kuò)大培養(yǎng)

按10%接種量擴(kuò)大培養(yǎng),比較RCVBN、RCVBN-乙酸鈉、乙酸鹽培養(yǎng)基三種培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果。

3 光合細(xì)菌培養(yǎng)條件的選擇

(1)菌種于30μE/m2·s光照條件下靜置培養(yǎng),接種量分別為10%和25%,定時(shí)測定培養(yǎng)液在660nm和485nm處的OD值,以O(shè)D660來表示培養(yǎng)液中細(xì)菌的生物量,以O(shè)D485來表示其中類胡蘿卜素的相對含量,描繪細(xì)菌的生長曲線。

(2)菌種于30μE/m2·s光照條件下分別進(jìn)行靜置培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng),檢測其生長狀況。

(3)菌種分別在6,16,30,40,60μE/m2·s光照條件下靜置培養(yǎng),于24h和48h時(shí)測定菌液的光吸收值,分析光照對細(xì)菌生長的影響。

4 色素的提取

4.1 收集菌體

6000rpm離心收集培養(yǎng)好的紅褐色菌液15min,棄去上清液,用生理鹽水洗滌2—3次,得到深紅色菌體。

4.2 抽提色素

(1)丙酮:甲醇抽提法[7]

將菌體用丙酮:甲醇(體積比7:2)懸浮,并加入相當(dāng)于10%甲醇量的 KOH,懸浮液總量約20m l/1.5g菌體,加入索氏提取器進(jìn)行減壓加熱(60℃水浴),回餾2h以上。

加入少量無水硫酸鈉振蕩,-20℃靜置后,取出上清液,7000—8000rpm離心去除菌體和蛋白質(zhì),減壓蒸餾,得到色素粗制品粉末,-20℃過夜。

將粗制品溶于少量石油醚中,加入等體積的甲醇,室溫下放置1—2h,去除下層甲醇后,上層用5% NaCl溶液洗滌3次,于40℃下減壓抽干石油醚,即得類胡蘿卜素精制品。

(2)石油醚:甲醇抽提法

用石油醚:甲醇(體積比2:1)懸浮菌體,加10%甲醇量的KOH,20 m l懸浮液/1.5 g菌體,加入索氏抽提器加熱回餾2—3h,蒸出大量石油醚和少量甲醇,直到回餾明顯減弱為止。

加入少量無水硫酸鈉于抽提液中,-20℃放置后,觀察到抽提液分兩層,上層墨綠,下層淺綠為菌體、蛋白質(zhì)和甲醇抽提液。

加石油醚于抽提液中,振蕩充分,靜置使其分層;若分層不明顯,可依次加入甲醇和水,振蕩后靜置分層。取出上層石油醚,將下層溶液再用石油醚抽提,重復(fù)2—3次,直至石油醚層顏色基本消失,將石油醚溶液依次用甲醇和水洗滌2—3次。最后,減壓抽干石油醚,即得產(chǎn)品。

5 結(jié)果分析與討論

5.1 培養(yǎng)條件對菌種生長和色素形成的影響

(1)由圖1,2,3可以看出,菌種延緩期長短與接種量有很大的影響,二者成反比,而微好氧的搖瓶培養(yǎng)可縮短延遲期,使菌體很快繁殖,達(dá)到穩(wěn)定期,因?yàn)樵谟醒鯒l件下,菌體可進(jìn)行 TCA循環(huán),代謝較快,一般搖床培養(yǎng)28小時(shí)即可,而靜置培養(yǎng)須40小時(shí)以上。由于類胡蘿卜素的生成隨光照強(qiáng)度增加而降低,因此光照不宜過強(qiáng),且菌體在光照3000lx下產(chǎn)量并不具有優(yōu)勢,只是在光照強(qiáng)度提高時(shí),有助于菌體迅速達(dá)到穩(wěn)定期,因此光照以1500lx左右為佳。

圖1 光合細(xì)菌的生長曲線及類胡蘿卜素的產(chǎn)生

圖2 光照對細(xì)菌生長的影響

圖3 靜置培養(yǎng)與搖瓶培養(yǎng)的比較

(2)由三種培養(yǎng)基:乙酸鹽培養(yǎng)基、RCVBN培養(yǎng)基、乙酸鈉乙酸銨培養(yǎng)基比較可見,在乙酸鈉乙酸銨和RCVBN培養(yǎng)基中菌體生長旺盛,乙酸鹽培養(yǎng)基中菌體含量很少,但很容易收集;RCVBN培養(yǎng)基中由于缺乏乙酸鹽或丙酸鹽等抑制雜菌生長的成分,培養(yǎng)基中有大量白色雜菌形成的菌團(tuán)懸浮,表面有白色菌膜,易于污染雜菌;并且RCVBN培養(yǎng)液離心時(shí)的菌體沉淀效果遠(yuǎn)不如乙酸鹽和乙酸銨培養(yǎng)基,前者離心時(shí)轉(zhuǎn)速以8000—10000 rpm效果為佳,而后二者在轉(zhuǎn)速4000 rpm時(shí)菌體沉淀的效果就較為徹底;再者, RCVBN培養(yǎng)基中以蘋果酸為碳源,蘋果酸價(jià)格昂貴,不宜于大規(guī)模使用。

光合細(xì)菌體積小,收集菌體過程中的動力消耗很大,而某些可以自然沉降的菌株又不能充分利用培養(yǎng)基,繁殖緩慢,菌體含量少。因此,便于收集菌體的價(jià)格低廉的培養(yǎng)基對于簡化生產(chǎn)工藝,降低生產(chǎn)成本,大規(guī)模生產(chǎn)類胡蘿卜素具有重要意義。

(3)使用乙酸鈉乙酸銨培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株時(shí),4000 rpm離心15分鐘后,用兩種不同的色素抽提方法提取類胡蘿卜素。

5.2 色素提取的結(jié)果分析

(1)菌體用丙酮:甲醇提取時(shí),二者均可破壞細(xì)胞膜,使細(xì)胞破裂,而丙酮對類胡蘿卜素的抽提有利,甲醇有利于葉綠素的提取;抽提后加入無水硫酸鈉可以出去抽提物中的蛋白質(zhì)等極性物質(zhì);10%的甲醇量的KOH是起皂化作用,除去油脂類;最后用甲醇洗去石油醚中的殘余葉綠素,加入可促進(jìn)石油醚和甲醇分層。

(2)類胡蘿卜素的經(jīng)典抽提方法多采用丙酮:甲醇抽提,與石油醚:甲醇抽提法相比,有以下問題:

A.由于石油醚和甲醇不相溶,抽提后可以直接將二者進(jìn)行分離,不須像丙酮那樣,抽提時(shí)需要蒸干抽提液,大大簡化了操作程序。

B.石油醚沸點(diǎn)低于丙酮,抽提方便,減壓抽干時(shí)也迅速,抽提溫度、時(shí)間與丙酮:甲醇抽提法相比,對色素的破壞也較輕。

C.石油醚不溶于水,可以輕易除去色素的石油醚溶液中的水分,易于抽提和減壓蒸餾,而丙酮則溶于水,抽提前需要先干燥菌體,否則將會因所含有的水分難以抽干。

D.在使用石油醚抽提法時(shí)應(yīng)注意:由于石油醚不能使細(xì)胞變性、破碎,因此最好加大甲醇的用量。

(3)最終得到的色素石油醚溶液中,如果漂浮有白色絮狀蛋白質(zhì)等雜物,可用水洗滌除去,而溶液中的少量水珠需仔細(xì)除凈,以免影響減壓抽干。

(4)石油醚:甲醇抽提法所得類胡蘿卜素產(chǎn)量可達(dá) 170mg/L培養(yǎng)液,而丙酮:甲醇抽提法只有71.2mg/L培養(yǎng)液。

6 結(jié)論

(1)對光合細(xì)菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行研究后,發(fā)現(xiàn)適當(dāng)增加菌種的接種量和光照強(qiáng)度、以及好氧培養(yǎng),均會提高光合細(xì)菌的生長速度。

(2)采用石油醚-甲醇抽提法對菌體中的類胡蘿卜素進(jìn)行提取,最終獲得的類胡蘿卜素產(chǎn)量為170mg/L培養(yǎng)液,菌體濕重為7.5g/L培養(yǎng)液;而丙酮:甲醇抽提法只有71.2mg/L培養(yǎng)液。

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