呂顯林 王琴 陳清 陶亮

大黃素對Cx32組成的細(xì)胞縫隙連接通訊功能的影響

呂顯林 王琴 陳清 陶亮

目的在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)Cx32的Hela細(xì)胞上，觀察大黃素對Cx32的GJIC以及Cx32蛋白表達(dá)水平的影響。方法 采用SRB法檢測不同濃度大黃素對Hela細(xì)胞的毒性;用細(xì)胞接種熒光示蹤法(“parachute”dye-coupling assay)觀察不同濃度大黃素對GJIC的影響;用western blot法研究大黃素在影響GJIC功能濃度范圍內(nèi)對Cx32蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果大黃素在0～1μmol/L濃度時對Hela細(xì)胞無毒性作用;大黃素(24～600nmol/L)預(yù)處理4 h，能濃度依賴性地增強GJIC及Cx32蛋白表達(dá)量。結(jié)論大黃素能夠增強Cx32的細(xì)胞GJIC;此增強作用可能與其增加Cx32蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

大黃素;縫隙連接蛋白;縫隙連接通訊

細(xì)胞縫隙連接(gap junction，GJ)是相鄰細(xì)胞間的一種蛋白質(zhì)通道結(jié)構(gòu)。該通道兩端分別開口于相鄰的細(xì)胞胞漿中，由各自細(xì)胞包膜上6個連接蛋白(connexin，Cx)圍繞中央孔組成的“半通道”對接而成。其重要功能是縫隙連接細(xì)胞間通訊(gap junction intercellular communication，GJIC)，溝通相鄰細(xì)胞的胞漿，允許細(xì)胞漿中分子量＜1kDa的小分子物質(zhì)，包括細(xì)胞代謝產(chǎn)物及細(xì)胞第二信使等通過，從而同步細(xì)胞活動、協(xié)調(diào)各細(xì)胞間活性和功能、控制細(xì)胞的生長和發(fā)育等生命過程［1］。GJ通過Cx結(jié)構(gòu)和功能的變化而導(dǎo)致的細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、腫瘤、視力和聽力障礙的發(fā)生密切相關(guān)［2，3］。因此，能糾正GJ功能異常的化合物有望成為治療上述疾病的新型藥物［4］。

大黃素具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化及清除氧自由基和保肝作用，還可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，增強藥物的細(xì)胞毒性作用，但其對GJ功能及Cx蛋白表達(dá)的影響尚未見報道。本文旨在研究大黃素對Cx32組成的GJ功能的影響。

1 資料與方法

1.1 試劑 大黃素購于自中國藥品檢驗所;抗HA抗體購自Sigma;多西環(huán)素購自Calbiochem;HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗、硝酸纖維素膜(NC膜)購于Amersham;ECL-plus化學(xué)發(fā)光劑購于Bio-rad;Calcein-AM和CM-DIL購自Molecular Probes。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 本實驗用含有Cx32 cDNA的PBI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，通過多西環(huán)素誘導(dǎo)，使HeLa細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)Cx并形成有效的GJIC。轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)Cx32的HeLa細(xì)胞于含10%新生牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，實驗前將細(xì)胞用細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。

1.3 SRB法測定藥物的細(xì)胞毒性［5］調(diào)整細(xì)胞濃度為2×103/ml，接種于 96孔板(200μl/孔)，空白為培養(yǎng)液。37℃，5%CO2孵育24 h后。加入不同濃度的大黃素作用4 h，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸出培養(yǎng)液，緩慢加入10%三氯醋酸(200μl/孔)，4℃靜置1 h。PBS沖洗，加入 SRB染色液(100μl/孔)，37℃，染色 30 min。1% 醋酸洗滌，加入 10 mmol/LTris液(150μl/孔)，振動5 ～10 min，直至染料全部溶解。酶標(biāo)儀564nm波長處測定OD值。重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞接種熒光示蹤法(Parachute Assay)［6］將表達(dá)Cx的Hela細(xì)胞與熒光指示劑calcine-AM和DiI-CM共同孵育，使其進入細(xì)胞，為“供體細(xì)胞”(donor cell)。將“供體細(xì)胞”接種到有相同表達(dá)Cx的Hela細(xì)胞(“接受細(xì)胞”，receiver cells)上，培養(yǎng)4 h后，顯微熒光系統(tǒng)觀察。計數(shù)1個“供體細(xì)胞”周圍含有calcine的“接受細(xì)胞”數(shù)作為GJ功能指標(biāo)。

1.5 Western Blot Hela細(xì)胞用冷PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液靜置2 h，12000r/min，4℃離心30 min，取上清。取30μg 蛋白經(jīng)上樣緩沖液變性處理，在含10%SDS-PAGE凝膠中電泳，然后電轉(zhuǎn)于硝化纖維素薄膜上。含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，加入鼠抗HA抗體(1：1000)4℃過夜。洗膜后，加入HPR標(biāo)記的羊抗鼠抗體(1：3000)室溫孵育2 h，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色，放射自顯影于X光膠片上，凝膠成像系統(tǒng)分析特異電泳條帶的灰階密度值。為使上樣量一致，相同的薄膜用小鼠抗人β-actin多克隆抗體(1：5000)進行雜交染色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗結(jié)果使用SPSS13.0軟件進行分析。計量資料兩組之間比較用t檢驗，多組之間比較用ANOVA分析，組間比較用LSD法，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計圖表用SigmaPlot10.0繪制。

2 結(jié)果

2.1 藥物對Hela細(xì)胞生長的影響 為排除藥物本身的細(xì)胞毒性或細(xì)胞增殖作用對GJ功能的影響，采用SRB法測定不同濃度大黃素對Hela細(xì)胞增殖的作用。結(jié)果提示，大黃素在0～1μmol/L范圍內(nèi)不影響Hela細(xì)胞存活率(圖1)。

圖1 大黃素對表達(dá)Cx32的Hela細(xì)胞存活率的影響

2.2 大黃素能夠增強由Cx32組成的GJ的功能 采用細(xì)胞接種熒光示蹤法(Parachute Assay)，分別測定不同濃度的大黃素對細(xì)胞GJ功能的影響(見圖2A、2B)。結(jié)果顯示，大黃素(24～600nmol/L)作用4 h，GJ介導(dǎo)的細(xì)胞間熒光傳遞呈濃度依賴性地增加，濃度0.6μM時，增強率達(dá)176%(圖2C)。

圖2 大黃素對由Cx32組成的GJ功能的影響

2.3 大黃素對Cx32蛋白表達(dá)的影響 采用免疫印跡法(western blotting)檢測大黃素對Cx32蛋白表達(dá)的影響。大黃素(24～600nmol/L)預(yù)處理4 h，可濃度依賴性地增強Cx32蛋白的表達(dá)(見圖3)。

圖3 大黃對Cx32的蛋白表達(dá)的影響

3 討論

本研究首次證明，大黃素可以濃度依賴性地增強Hela細(xì)胞的GJ功能和Cx表達(dá)，但調(diào)控Cx32蛋白表達(dá)的機制尚未清楚，仍有待進一步研究證實。現(xiàn)已知多種因素能夠調(diào)節(jié)GJ功能，主要包括：直接控制Cx通道的啟閉、調(diào)控Cx蛋白的表達(dá)、通過Cx磷酸化/去磷酸化等進行表達(dá)后修飾，其中細(xì)胞Cx蛋白的表達(dá)量是主要因素。文獻報道，姜黃素類似物，大多數(shù)類黃酮化合物紅桔素，蒜臭素［7］，人參、丹參酮［8］等對GJ功能均有一定的調(diào)節(jié)作用，作用機制可能與下調(diào)腺苷酸環(huán)化酶活性，上調(diào)蛋白激酶C，誘導(dǎo)Cx的磷酸化有關(guān)［9，10］。據(jù)報道，GJ能顯著增強順鉑和依托泊苷引起的細(xì)胞凋亡［11］，增強順鉑抑制膀胱癌細(xì)胞生長、減少BCL-2表達(dá)和引起細(xì)胞凋亡的作用［12］。因此，能增強GJ功能的藥物可能具有抑制腫瘤生長和增強抗腫瘤藥物療效的雙重作用。

最新發(fā)現(xiàn)，大黃素具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和抗腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能，能增強藥物的細(xì)胞毒性作用，如可顯著增強5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡［13］;增強順鉑抑制HepG2胞增殖的效應(yīng);增強三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［14］。本研究首次證明大黃素能夠增強GJ功能。這一發(fā)現(xiàn)提示，大黃素有可能通過增強GJ功能而增強藥物的抗腫瘤作用。

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The effect of Emodin on the function of gap junction composed of Cx32

LV Xian-lin，WANG Qin，CHEN Qing，et al.Department of Pharmacy，Hengli People’s Hospital of Dongguan city，Dongguan 523460，China

ObjectiveTo investigate the effect of Emodin on gap junction intercellular communication and the expression of Cx32 protein in Cx32-transfected Hela cells.MethodsSRB assay was used to detect the cytotoxicity of emodin on Hela cells.The function of GJIC was determined by“parachute”dye-coupling assay;Western blot was performed to detect the expression of Cx32.ResultsEmodin with concentration of 0～1μmol/L had no cytotoxicity on Hela cells;Pre-treatment the cells with Emodin with concentration of 24～600nmol/L for 4 hours could increase the intercellular dye transfer and the Cx32 protein expression.ConclusionEmodin could enhance the function of gap junction in Cx32-transfected Hela cells，probably through increasing the Cx32 expression.

Emodin;Connexin;Gap junction intercellular communication

523460 東莞市橫瀝人民醫(yī)院藥劑科(呂顯林);中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室(王琴 陶亮);中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部(陳清)