王健 李興

高糖環(huán)境下脂聯(lián)素對人腎小管上皮細胞增殖和Caspase-3的影響

王健 李興

目的探討脂聯(lián)素(Adiponectin，ADPN)對高糖環(huán)境下人近曲腎小管上皮細胞增殖、凋亡及T-鈣黏蛋白(T-cadherin)表達的影響，揭示脂聯(lián)素在糖尿病腎病中的保護作用。方法將人近曲腎小管上皮細胞用5.5 mmol/L葡萄糖(正常對照組)、30.0 mmol/L葡萄糖(高糖組)、30.0 mmol/L+2.5μg/ml ADPN(脂聯(lián)素組)分別培養(yǎng)24 h，48 h，72 h后，運用MTT法測定細胞增殖，運用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定細胞上清液中Caspase-3的含量，觀察細胞凋亡。結果①高糖組人近曲腎小管上皮細胞增殖被抑制(P＜0.05)，加入脂聯(lián)素(2.5μg/ml)后促進了細胞增殖(P＜0.05)，并呈時間依賴性。②高糖組人近曲腎小管上皮細胞凋亡增加(P＜0.05)，加入脂聯(lián)素(2.5μg/ml)后延緩了細胞凋亡。結論高糖環(huán)境下隨著時間的延長，可引起腎小管上皮細胞增生肥大，誘導其凋亡;脂聯(lián)素可促進細胞增殖，延緩細胞凋亡。

脂聯(lián)素;腎小管上皮細胞;細胞凋亡

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見和最嚴重的并發(fā)癥之一，嚴重影響著患者的生活質量和生存率。每年大約有30%～40%DN進展為終末期腎功能衰竭(ESRD)。DN發(fā)病機制尚不清楚，多數學者認為其發(fā)病是多種細胞因子、生長因子、激素等對高血糖的綜合反應的結果。其主要病理改變是細胞外基質(ECM)在腎小管、腎小球聚集，最終導致腎小球硬化和腎間質纖維化。近年來隨著對DN研究的深入，人們已認識到與腎小球相比，腎小管間質病變對腎功能影響更大。DN早期即可發(fā)生腎小球硬化(包括小球基底膜增厚和系膜增寬)和腎小管間質纖維化。腎小管間質包括腎小管上皮細胞、血管和間質成分，占腎臟體積的90%以上。DN的腎小管間質相關病理表現有:腎小管基底膜增厚、腎小管營養(yǎng)不良、間質纖維化和動脈硬化。而腎小管上皮細胞損傷后的改變被認為是腎間質纖維化的起始因素。因而，保護腎小管上皮細胞，減少其損傷，去除腎間質纖維化的起始因素，成為本研究的一個切入點。Caspase-3是Caspase家族中的最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是細胞凋亡的關鍵執(zhí)行者，是細胞凋亡過程中的主要效應因子。脂聯(lián)素(Adiponectin，ADPN)是近年來發(fā)現的對糖尿病有保護作用的蛋白質，主要由脂肪細胞分泌。多項研究證明脂聯(lián)素有抗氧化［1］、抗動脈粥樣硬化、保肝、抗纖維化及抗炎［2］等多種保護作用，可能在DN發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義。本研究旨在通過高糖環(huán)境中脂聯(lián)素對人腎小管上皮細胞增殖及Caspase-3的影響，探討脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) HK-2細胞株為人近曲腎小管上皮細胞，購買于中國醫(yī)學科學院細胞庫中心，實驗使用第2、3代細胞。HK-2細胞株生長于含10%胎牛血清(FBS)的低糖DMEM培養(yǎng)液中(D-葡萄糖濃度5.5mmol/L)，置于含5%CO2濃度的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培育，每3～4天用0.25%胰酶消化傳代，待細胞生長至亞融合狀態(tài)時，一部分接種于96孔細胞培養(yǎng)板，接種密度為1×105個/m l，待細胞貼壁后，改用無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細胞同步化后，棄去舊的培養(yǎng)液后用于下一步實驗;一部分直接更換為無血清DMEM培養(yǎng)基使細胞生長同步化24 h，用于下一步實驗。

1.2 實驗分組

1.2.1 細胞增殖檢測 ①正常對照組(N組):培養(yǎng)基中含有生理濃度的D-葡萄糖(5.5 mmol/L);②高糖組(G組):培養(yǎng)基D-葡萄糖濃度為30 mmol/L;③脂聯(lián)素組(A組):在G組的基礎上加入外源性ADPN，使ADPN濃度達2.5μg/ml。

1.2.2 Caspase3表達的檢測 ①正常對照組(N組):培養(yǎng)基中含有生理濃度的D-葡萄糖(5.5 mmol/L);②高糖組(G組):培養(yǎng)基D-葡萄糖濃度為30 mmol/L;③脂聯(lián)素組(A組):在G組的基礎上加入外源性ADPN，使ADPN濃度達2.5 μg/ml。

1.2.3 MTT方法檢測細胞增殖 將對數生長期細胞以1×105/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板中。孵育24 h后，改用無血清培養(yǎng)液孵育24 h，使細胞處于相對靜止期后按如上方法分為3組，每組設3個復孔，同時設調零孔。分別培育24 h、48 h、72 h進行MTT檢測。為排除培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分消耗對結果的影響，每隔48 h換一次培養(yǎng)液。反應結束后每孔加入25μl MTT(5 mg/ml)溶液，繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入100μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩30 min后于酶標儀490 nm處測光吸收(OD)值(OD值越大，表明細胞增殖越旺盛)。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附技術測細胞培養(yǎng)液中caspase-3的水平

將對數生長期細胞以1×104/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板中。孵育24 h后，改用無血清培養(yǎng)液孵育24 h，使細胞處于相對靜止期后按以上方法隨機分為三組，每組設3個復孔，同時設調零孔，分別培育24 h、48 h、72 h后收集細胞培養(yǎng)上清液進行ELISA檢測

2 結果

2.1 高糖對人腎小管上皮細胞增殖及凋亡的影響 24 h、48 h、72 h G組與N組比較細胞增殖受抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);24 h、48 h、72 h G組與N組比較細胞凋亡增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1、2。

2.2 脂聯(lián)素對人腎小管上皮細胞的影響 24 h、48 h和72 h A組與G組比較細胞增殖能力明顯增加(P＜0.05);細胞凋亡受抑制。在72 h脂聯(lián)素組細胞增殖旺盛，生長狀態(tài)良好， 呈亞融合狀態(tài)。見表1、2。

表1 脂聯(lián)素對人腎小管上皮細胞增殖的影響(OD值)(±s，n=3)

表1 脂聯(lián)素對人腎小管上皮細胞增殖的影響(OD值)(±s，n=3)

注:與對照組相比，*P＜0.05;與高糖組相比，#P＜0.05

0.348±0.017 0.558±0.061 0.724±0.011高糖組 0.478±0.006* 0.367±0.014* 0.261±0.011*脂聯(lián)素組 1.026±0.009# 1.237±0.009# 1.977±0.009 24 h 48 h 72 h對照組分組#

表2 高糖及脂聯(lián)素對人腎小管上皮細胞上清液中caspase-3表達的影響(ng/ml，n=3)

3 討論

近年來，糖尿病的患病率逐年升高，已經成為一個威脅人類健康的全球性重大疾病。2008年，國際糖尿病聯(lián)合會調查顯示，目前糖尿病病例數約為1.9億，帶來了嚴重的社會問題。如何有效治療糖尿病成為科學研究的焦點，而治療糖尿病的關鍵之一是預防和延緩各種糖尿病并發(fā)癥(如心腦血管疾病、糖尿病腎病、視網膜病變等)的發(fā)生、發(fā)展。近年調查及研究表明，糖尿病并發(fā)癥已成為糖尿病患者致殘和致死的主要原因。而糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最嚴重和最常見的慢性并發(fā)癥之一，是終末期腎病(ESRD)的最常見病因［3］。

糖尿病腎病(DN)發(fā)病機制目前尚未完全闡明。目前多數學者認為與遺傳易感性、胰島素抵抗、糖代謝異常、細胞因子、氧化應激以及由此引起的腎臟血流動力學改變等有關。其主要病理改變是細胞外基質(ECM)在腎小管、腎小球的聚集，而最終導致腎小球硬化及腎間質纖維化。由于近曲腎小管在腎單位所處的位置特殊和其重吸收功能，腎小管與尿液直接接觸，尿液中的蛋白、細胞因子等有害物質可直接引起腎小管上皮細胞損傷、活化及表型轉化，并釋放多種炎性因子和生長因子。另外腎臟血流動力學改變、非酶糖化、激素水平異常、蛋白激酶C(PKC)的激活和多元醇途徑等在腎臟小管間質病變中也發(fā)揮著重要作用。而腎小管上皮細胞損傷后的改變被認為是腎間質纖維化的起始因素，主要因為腎小管上皮細胞在結構上與腎間質緊密相連，損傷后可直接參與間質炎癥、纖維化、或通過吸引間質炎性細胞浸潤和促進間質固有細胞增殖，而在間質纖維化過程中起重要作用。糖尿病狀態(tài)下，由于尿糖的產生及間質組織、腎小管周圍血管中葡萄糖濃度升高，使近端腎小管細胞持續(xù)處于高糖環(huán)境中，誘導細胞凋亡，引起腎小管萎縮，進而發(fā)生腎小管間質纖維化，導致不可逆的終末期腎功能衰竭(ESRD)。因而，積極保護腎小管上皮細胞能夠有效延緩腎小管間質纖維化，對防治DN的進展有重大意義。

細胞凋亡主要通過三條基本途徑-死亡受體途徑、線粒體途徑和內質網途徑完成的。這三條通路的誘因以及起始部分不同，但殊途同歸，最終都引起caspase-3的活化，導致細胞凋亡性死亡。Caspase家族是細胞凋亡調控的關鍵元件，其激活或超常表達均會誘發(fā)細胞凋亡［4］，而caspase-3是caspase家族中重要成員之一，人caspase-3基因定位于染色體上4q32-4q35.1，其廣泛分布于各種不同類型的細胞中，表達在多種正常組織中，在一些惡性腫瘤的組織中也有表達。正常情況下，它以無活性的前caspase-3形式存在于胞質中，當細胞受到凋亡因素刺激時，它會被系列反應激活誘導細胞凋亡。

本實驗以人近曲腎小管上皮細胞株為研究對象，觀察到在高糖環(huán)境下，隨著時間的延長，腎小管上皮細胞增殖明顯受抑，細胞凋亡增加。說明糖尿病時，高糖是誘導腎小管上皮細胞損傷的主要因素。與Samikkannu等［5］及Xing等［6］的研究發(fā)現一致。即將原代培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞短時間暴露于高糖環(huán)境下可產生雙重效應，先出現細胞增殖，隨后細胞凋亡增加。但隨著作用時間的延長，細胞增殖受抑制，至96 h出現細胞增殖停滯的現象，細胞形態(tài)發(fā)生肥大。而在加入脂聯(lián)素干預組中，腎小管上皮細胞的增殖未受抑制，且隨著干預時間的延長細胞增殖能力明顯增加，細胞凋亡減少。說明脂聯(lián)素能促進高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞的增殖，延緩其凋亡，減輕細胞損傷，對細胞具有保護作用。

［1］Mossalam M，Jeonq JH，Abel ED，et al.Reversal of oxidative stress in endothelial cells by controlled released of adiponectin.JControl Release，2008，130(3):234-237.

［2］Yokota T，Oritani K，Takahashi I，et al.Adiponectin，a newmember of the family of soluble defense collagens，negatively regulates the growth ofmyelomonocytic progenitors and the function ofmacrophages.Blood，2000，96(5):1723-1732.

［3］Hug C，wang J，Ahmad NS，et al.T-cadherin is a receptor for hexameric and high molecular weight forms of Acrp30/adiponectin.Proc Natl Acad sci USA，2004，101(28):10308-10313.

［4］Yan Zhang，Cynthia Goodyer，Andren Le Blanc.Selective and protracted apoptosis in Human primary neuronsmicroinjection with active caspase-3，-6，-7and-8.Neurosci，2000，20:8384-8389.

［5］Samikkannu T，Thomas JJ，Bhat GJ，et al.Acute effect of high glucose on long2term cell growth:a role for transient glucose increase in proximal tubule cell injury.Am JPhysiol Renal Physiol，2006，291(1):162-175.

［6］Xing L，Muxun Z.Expression of c-met stimulated by high glucose in human renal tubular epithelial cells and its implication.Huazhong Univ Sci TechnologMed Sci，2007，27(2):161-163.

030001 山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院內分泌科

李興 E-mail:lixinglaoshi@yahoo.com.cn