李 偉,張振剛

(揚(yáng)州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院江蘇省揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,江蘇揚(yáng)州,225001)

心肌炎(嗜心肌病毒感染或自身免疫性炎癥)導(dǎo)致的擴(kuò)張型心肌病(DCM)日益受到重視。Jay W Mason提出了心肌炎的三步級聯(lián)學(xué)說,闡述了心肌炎和DCM的內(nèi)在聯(lián)系,即由急性炎癥反應(yīng)期,自身免疫介導(dǎo)的慢性遷延期,心肌纖維化、心室重構(gòu)的三階段模式導(dǎo)致DCM的發(fā)生[1]。因而,在心肌炎向DCM的轉(zhuǎn)化過程中炎癥因子相關(guān)的左心室重構(gòu)起到了至關(guān)重要的作用。

NF-κ B能調(diào)控免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化和生長、細(xì)胞黏附和細(xì)胞凋亡所必需的許多細(xì)胞因子、黏附因子,它可以啟動和調(diào)節(jié)這些基因的轉(zhuǎn)錄,在機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用,因而推測NF-κ B在心肌炎后的左心室重構(gòu)進(jìn)程中可能存在重要作用。本實(shí)驗(yàn)著重觀察了大鼠心肌炎后左心室重構(gòu)、心功能及外周血中炎癥細(xì)胞因子水平的變化,并初步探究其機(jī)制是否部分通過NF-κ B來調(diào)控,從而為研究藥物的作用靶點(diǎn)及機(jī)制,延緩心肌炎向DCM轉(zhuǎn)化的疾病發(fā)展過程提供一定的依據(jù)。

1 材 料

7周齡SPF級雄性Lewis大鼠 28只,體質(zhì)量130～170 g,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2002～0003。飼養(yǎng)在屏障系統(tǒng)中(溫度22～26℃,濕度50%～60%),自由飲用純凈水和食用標(biāo)準(zhǔn)合成的大鼠飼料。豬心肌球蛋白(編號:M-0531)、弗氏完全佐劑(編號:F-5881)、多聚賴氨酸、Ⅰ型、Ⅲ型膠原單克隆抗體購自Sigma公司;小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自華美生物工程公司;SABC免疫組化試劑盒(羊抗鼠)購自武漢博士德生物工程有限公司;細(xì)胞因子試劑盒購自美國RB公司;細(xì)胞及組織總蛋白抽提試劑、NF-κ B Pathway Activation試劑盒購自上?？党缮锕尽?50型酶標(biāo)儀(Beckman),4℃離心機(jī):SIGMA,核酸蛋白定量儀(德國Eppendorf),IBAS 2.5全自動圖像分析儀(德國Kontron),BX15型顯微鏡(日本Olympus),病理圖文分析系統(tǒng)(瑞醫(yī)RY-2000)。

2 方 法

2.1 模型制備與實(shí)驗(yàn)分組

模型組(14只),參照文獻(xiàn)[2]方法,用豬心肌球蛋白免疫大鼠制備EAM模型;正常對照組(14只):于同時間同部位注射等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)直至結(jié)束,EAM模型組共存活了13只大鼠。

2.2 心臟結(jié)構(gòu)和功能的評估

實(shí)驗(yàn)第 70天應(yīng)用超聲心動圖儀(型號:PHLIP Sequoia C256,探頭頻率:3～5 MHz)行心臟檢查。大鼠禁食12 h,禁飲2 h后,用氯氨酮50 mg/kg+安定5 mg/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉后測量左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、縮短分?jǐn)?shù)(FS)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF);測量3個連續(xù)心動周期的圖像,取平均值。

2.3 左心室重量和左心室質(zhì)量指數(shù)的評估

心臟由濾紙輕吸后沿房室環(huán)剪去心房及右心室游離壁稱量讀數(shù)即為左心室重量(LVW)(單位mg),左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)(單位mg/g)由左心室重量(mg)/大鼠體重(g)得出。

2.4 組織學(xué)鏡檢

稱重后將心臟分成心尖部,中間部和心底部三部分。中間部心肌做冰凍切片行Ⅰ型和Ⅲ型膠原檢查,心尖部分用液氮罐凍存。

2.5 血清中 TNF-α、IL-1、MCP-1 的檢測

血清中 TNF-α、IL-1、MCP-1的測定采用ELISA法。按照試劑盒說明書操作,酶標(biāo)儀450 nm處測OD值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣品中TNF-α、IL-1、MCP-1 的濃度。

2.6 心肌組織NF-κ B活性測定

核蛋白提取方法如下:取液氮凍存心尖組織,4℃PBS溶液中解凍后稱重,每250 mg組織中加入1mL蛋白質(zhì)抽提試劑(1 mL抽提試劑中加入5 μ L蛋白酶抑制劑混合液,5 μ L PMSF和5 μ L磷酸酶抑制劑混合液),勻漿器低速勻漿,4℃14 000 g離心15 min后收集上清,-80℃保存。樣品蛋白濃度采用核酸蛋白定量分析儀測定。采用ELISA法測定NF-κ B的活性,按照試劑盒說明書操作。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 心臟結(jié)構(gòu)和功能

如表1和圖1所示,與Control組相比,EAM組LVEDD、LVESD均明顯增加(P<0.01),LVEF明顯下降(P<0.01)、FS也下降(P<0.05)。

表1 心肌炎后大鼠心臟超聲參數(shù)的變化(n=27,±s)

表1 心肌炎后大鼠心臟超聲參數(shù)的變化(n=27,±s)

注:與正常對照組相比,＊P<0.05,#P<0.01

Group Control(n=14) EAM(n=13)LVESD(mm) 2.60±0.26 4.18±0.32#LVEDD(mm) 5.13±0.06 6.43±0.28#EF(%) 89.00±3.00 66.00±7.48#FS(%) 67.67±7.37 50.39±11.86＊

圖1 各組大鼠的彩超評估

3.2 左心室重構(gòu)質(zhì)量指數(shù)的評價

EAM組LVW相比于Control組明顯增加(P<0.01),而 EAM 組LVMI相比于Control組亦明顯增加(P<0.01)。見表2。

表2 各組左心室重量及左心室質(zhì)量指數(shù)(即左心室重量/體重)的變化(n=27,±s)

表2 各組左心室重量及左心室質(zhì)量指數(shù)(即左心室重量/體重)的變化(n=27,±s)

注:與正常對照組相比,#P<0.01。

Group Control(n=14) EAM(n=13)LVW(mg) 787.63±51.28 921.89±70.84#LVMI(mg/g) 1.80±0.10 2.27±0.12#

3.3 免疫組化法染色膠原纖維

圖2和圖3顯示:Control組心肌細(xì)胞間和血管周圍見少量棕黃色Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維;與Control組相比,EAM組Ⅰ、Ⅲ型膠原均呈明顯增生分布(P<0.01),其中Ⅰ型多于Ⅲ型,Ⅰ/Ⅲ比值均增加(P<0.01);見表3。

表3 心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原面積(×104)及Ⅰ/Ⅲ比值的比較(±s,n=27)

表3 心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原面積(×104)及Ⅰ/Ⅲ比值的比較(±s,n=27)

注:與正常對照組相比,#P<0.01。

Group Control(n=14) EAM(n=13)CollagenⅠ 3.45±1.61 25.80±2.02#CollagenⅢ 2.37±1.41 7.07±0.65#Ⅰ/Ⅲ 1.57±0.38 3.67±0.42#

3.4 外周血清中細(xì)胞因子濃度變化

與 Control相比,EAM 組 TNF-α、IL-1、MCP-1的濃度明顯升高(P<0.01),見表4。

表4 各組大鼠血清中細(xì)胞因子的水平(n=27,±s)

表4 各組大鼠血清中細(xì)胞因子的水平(n=27,±s)

注:與正常對照組相比,＊P<0.05,#P<0.01。

Group(pg/mL) Control(n=14) EAM(n=13)TNF-α 76.67±13.50 211.58±66.23#IL-1 81.20±49.09 821.88±326.08#MCP-1 103.55±24.55 207.17±75.37＊

圖2 大鼠心肌組織Ⅰ型膠原染色 200倍

3.5 各組心肌組織NF-κ B活性的變化

Control組心肌NF-κ B活性很低,EAM 組中活化的NF-κ B升高(P<0.01);見圖4。

4 討 論

圖3 大鼠心肌組織Ⅲ型膠原染色 200倍

圖4 大鼠心肌組織NF-κ B活性的變化

心肌炎和擴(kuò)張型心肌病至今發(fā)病機(jī)制不清,大量國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究均集中在急性期階段,認(rèn)為抑制急性期相關(guān)指標(biāo)能緩解癥狀延緩疾病進(jìn)展;然而除重癥心肌炎或有明顯臨床癥狀的心肌炎患者外,部分心肌炎開始無特異癥狀,待臨床上發(fā)現(xiàn)時多已出現(xiàn)早期心臟結(jié)構(gòu)、大小的改變或晚期心力衰竭的癥狀,所以研究心肌炎后的左心室重構(gòu)是有臨床意義的。

實(shí)驗(yàn)中觀察到EAM大鼠出現(xiàn)少動,倦怠,易激惹,足部陸續(xù)出現(xiàn)潰瘍,部分還出現(xiàn)踝關(guān)節(jié)腫脹;第28天血清中出現(xiàn)抗肌球蛋白抗體;第70天后發(fā)現(xiàn)EAM大鼠心臟呈灰白色,彈性差,心臟體積增大,LVW和LVMI增加,隨后的免疫組化染色顯示EAM大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維顯著增生,提示EAM大鼠發(fā)生了左心室重構(gòu)。此時實(shí)驗(yàn)中EAM大鼠外周血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、MCP-1亦顯著增加。這是因?yàn)樾募√禺愋宰陨砻庖叻磻?yīng)的起始依賴于將抗原呈遞給T細(xì)胞以及DC的活化。在免疫反應(yīng)中針對的抗原主要是心肌肌球蛋白[3],肌球蛋白釋放后,被抗原提呈細(xì)胞吞噬,在共刺激分子的輔助下,激活了針對心肌肌球蛋白的自身反應(yīng)性T細(xì)胞,釋放炎癥細(xì)胞因子如 TNF-α[4-5]、IL-1 、IL-2 、MCP-1、INF-γ等共同促進(jìn)心肌間質(zhì)的抗原提呈細(xì)胞上調(diào)MHC分子的表達(dá),增加了心肌肌球蛋白α重鏈表位的提呈能力,因而心臟固有淋巴細(xì)胞和浸潤淋巴細(xì)胞的活化以及局部細(xì)胞因子的釋放,形成了一個炎癥環(huán)境,導(dǎo)致免疫反應(yīng)的起始和維持,自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被募集到心肌周圍及實(shí)驗(yàn)免疫的部位,發(fā)揮致病效應(yīng);另外補(bǔ)體系統(tǒng)、粒細(xì)胞、樹狀突細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞的激活[6]和自身抗體的產(chǎn)生在心肌炎的進(jìn)展過程中亦起一定作用。在實(shí)驗(yàn)中TNF-α能降低左室功能,導(dǎo)致左室重塑及代謝消耗、微血管內(nèi)凝血[7];MCP-1又可以造成 IL-1、IL-2、INF-γ、TNF-α等炎癥因子趨化聚集在炎癥周圍,加重炎癥反應(yīng),故而第70天彩超提示EAM組大鼠左心室擴(kuò)大,心臟收縮力下降,這與Horii[8]和 Yuji Okura[9]的結(jié)果相符合;此外,心臟浸潤的免疫細(xì)胞及它們的產(chǎn)物,如活性氧簇、細(xì)胞因子、蛋白酶(包括基質(zhì)金屬蛋白酶)、抗體等,損傷心肌細(xì)胞并導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)改變。當(dāng)調(diào)節(jié)機(jī)制失代償時,心肌間質(zhì)細(xì)胞表型改變,成纖維細(xì)胞增殖,細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分分泌異常增多[10],局部損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞機(jī)能障礙和死亡、替代性纖維變性以及心功能障礙,從而一定程度上造成了心肌炎后心肌纖維化,心室重構(gòu)的表現(xiàn)。既往的實(shí)驗(yàn)表明TNF-α在該模型中至關(guān)重要,趙培等研究顯示在急性期TNF-α濃度極高[11],在本實(shí)驗(yàn)中TNF-α雖較正常組明顯升高,但濃度較急性期是下降的,那么后期的病理改變除了TNF-α的重要作用外,可能還與IL-1相關(guān),從結(jié)果中看到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時IL-1的濃度還較正常組高了10倍左右,并沒有因?yàn)楹笃诩毙匝装Y的消退而明顯下降,由此看出后期心室重構(gòu)與IL-1的持續(xù)引起心肌細(xì)胞肥大,細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡,同時產(chǎn)生負(fù)性肌力作用造成心功能的下降有關(guān);心肌炎癥產(chǎn)生的IL-1、TGF-β等能調(diào)控MMPS,誘導(dǎo)MMPs基因表達(dá),使其活性升高,引發(fā)心肌膠原的降解[12],MMPs/TIMPs的平衡遭到破壞后,心肌膠原的合成增多,膠原的成分比例發(fā)生改變,Ⅰ型、Ⅲ型膠原增生,左心室重構(gòu)形成。

由上看出心肌炎后左心室重構(gòu)的過程十分復(fù)雜,不僅僅是抑制一種或幾種炎癥因子就能阻止其進(jìn)展的,在這整個過程中,炎癥因子的合成、釋放必然要經(jīng)歷一個由胞膜到胞漿,再由胞漿到胞核的信號傳導(dǎo)過程,最后必須再經(jīng)過核內(nèi)傳遞才能誘導(dǎo)相關(guān)炎性基因的表達(dá),而NF-κ B正是此過程的核心[13-14]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常對照組心肌NF-κ B活性很低,EAM 組NF-κ B的活性要高于正常對照組,NF-κ B是一種活躍的轉(zhuǎn)錄因子,參與多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子基因的表達(dá)調(diào)控,在靜息狀態(tài)下NF-κ B與其天然抑制因子Iκ B結(jié)合存在于胞質(zhì)內(nèi),當(dāng)細(xì)胞受到刺激后Iκ B被磷酸化,隨之被泛素化蛋白小體降解釋放NF-κ B進(jìn)入胞核,NF-κ B結(jié)合與靶基因啟動子上的順式作用元件,從而促使基因表達(dá)形成并放大炎癥反應(yīng)[15];故而實(shí)驗(yàn)中NF-κ B可能刺激炎癥性細(xì)胞因子的分泌產(chǎn)生大量致炎癥細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、IL-2、TGF-β、TNF-α等)、趨化因子(MCP-1)、粘附分子、急性期蛋白等,從而導(dǎo)致心肌的炎癥反應(yīng),由此實(shí)現(xiàn)NF-κ B激活,完成其作為一種核轉(zhuǎn)錄因子而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能。所以實(shí)驗(yàn)中看到即使在急性心肌炎后,NF-κ B的活性仍然高于正常對照組,NF-κ B的激活伴隨了心肌炎-心肌病的全過程,正是由于NF-κ B的激活導(dǎo)致了炎癥因子的大量釋放,造成了大鼠心肌炎癥反應(yīng),同時也影響了心肌間質(zhì)的成分及結(jié)構(gòu)的改變,從而促進(jìn)了心肌炎后大鼠左心室重構(gòu)的發(fā)生。劉東華等[16]通過病例對照分析,采用免疫組化等方法檢測到心力衰竭患者NF-κ B表達(dá)增高,細(xì)胞因子 TNF-α、IL-l、IL-6分泌增多;而Shioji等在急性期EAM 大鼠中用免疫組化法檢測心肌組織有NF-κ B的顯著表達(dá),且其表達(dá)水平與心肌病變程度相關(guān)[17]。因而我們有理由推測心肌炎后的左心室重構(gòu)至少部分與激活的NF-κ B可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控炎癥網(wǎng)絡(luò)分子的表達(dá)相關(guān),抑制其激活可以抑制炎癥介質(zhì)的合成和瀑布式級聯(lián)反應(yīng),從而可能阻斷病理效應(yīng),延緩左心室重構(gòu)的發(fā)展。

[1] Mason JW.Myocarditis and dilated cardiomyopathy:An inflammatory link[J].Cardiovascular Research,2003,60(1):5.

[2] Horii T,Tambara K,et al.Residual fibrosis affects a longterm result of left ventricular volume reduction surgery for dilated cardiomyopathy in a rat experimental study[J].Eur cardio-thoracic Surgery,2004,26(6):1174.

[3] 汪朝暉,廖玉華.肌球蛋白致自身免疫性心肌疾病的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華心血管病學(xué)雜志,2003,31(12):937.

[4] Yuki Yoshida,Tetsuo Shioi,et al.Resveratrol Ameliorates experimental autoimmune myocarditis[J].Circulation,2007,71:397.

[5] Maeda K,Shioi T,et al.Rapamycin ameliorates experimental autoimmune myocarditis[J].Int Heart,2005,46(3):513.

[6] Suresh PS,Kenichi W,et al.Involvement of Mast Cells in the Development of Fibrosis in Rats with Postmyocarditis Dilated Cardiomyopathy[J].Biol Pharm Bull,2005,28:2128.

[7] Bolger AP,Anker M.Tumour necrosis factor in chronic heart failure:a peripheral view on pathogenesis,clinical manifestations and therapeutic implications[J].Drags,2000,60(6):1245.

[8] Horii T,Tambara K,et al.Residual fibrosis affects a longterm result of left ventricular volume reduction surgery for dilated cardiomyopathy in a rat experimental study[J].Eur cardio-thoracic Surgery,2004,26(6):1174.

[9] Node K,Fujita M,et al.Short-term statin therapy improves cardiac function and symptoms in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy[J].Circulation,2003,108(7):839.

[10] Afanasyeva M,Georgakopoulos D,et al.Autoimmune myocarditis:cellular mediators of cardiac dysfunction[J].Autoimmun Rev,2004,3(7-8):476.

[11] Zhengang Zhang,Pei Zhao,et al.Effects of methotrexate on plasma cytokines and cardiac remodeling and Function in postmyocarditis rats[J].Mediators of Inflammation,2009,10:1155.

[12] LiYY Mc,Tiernan CF,Feldman AM.Interplay of matrixmetal Loproteinases,tissue inhibitors of metal loproteinases and the irregulator sincardiac matrixremodeling[J].Cardiovasc Res,2000,468:2142.

[13] Christman JW,Lancaster LH,et al.Nuclear factorκ B:a pivotal role in the systemic inflammatory response syndrome and new target for therapy[J].Intensive Care Med,1998,24:1131.

[14] 李欣,廖曉星.核因子κ B在全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征中的作用[J].中國急救醫(yī)學(xué),2002,22(5):303.

[15] Thanos D,Maniatis T.NF-kappa B:A lesson in family value[J].Cell,1995,80(4):529.

[16] 劉東華,劉應(yīng)才,潘金生.心力衰竭患者核因子-κ B活化與細(xì)胞因子分泌的相關(guān)性研究[J].四川醫(yī)學(xué),2006,27:706.

[17] Shioji K,Kishimoto C,et al.Upreagulation of thioredoxin expression in gaint cell myocarditis in rats[J].Febs Lett,2000,472(1):109.