楊永凈,劉士新,刁建東

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院 放療二科,吉林 長(zhǎng)春 130012;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 腫瘤血液科,吉林 長(zhǎng)春 130033）

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma）是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在頭頸部惡性腫瘤中占首位。放射治療是鼻咽癌的主要治療手段,但鼻咽癌的放療療效受腫瘤細(xì)胞放射敏感性的限制。近年的研究表明,腫瘤細(xì)胞的放射敏感性與細(xì)胞在增殖周期各時(shí)相的分布密切相關(guān),因此本研究選擇具有細(xì)胞周期阻滯效應(yīng)的紫杉醇與放射治療聯(lián)合應(yīng)用,以探討其對(duì)細(xì)胞放射敏感性的影響及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株、藥物和試劑人鼻咽癌CNE細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。紫杉醇為山西普德公司產(chǎn)品。噻唑藍(lán)(MTT）、二甲基亞砜(DMSO）購(gòu)自Sigma公司,RPMI-1640、胰蛋白酶購(gòu)自GIBCO公司,胎牛血清購(gòu)自天津TBD公司。

1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)條件人鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基中,37℃,5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 MTT法測(cè)定藥物IC50及IC10值鼻咽癌細(xì)胞按5×103/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板,待貼壁生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),加入稀釋后的紫杉醇,使其終濃度依次為 10-5、10-6、10-7、10-8、10-9μ mol/ml。每一濃度設(shè)3復(fù)孔,并設(shè)正常對(duì)照孔及空白調(diào)零孔。置37℃培養(yǎng)箱孵育24 h后,棄去藥物及陳舊培養(yǎng)基,每孔加新鮮配制的MTT(5 mg/ml）20 μ l再次孵育4 h,棄去MTT 液,每孔加DMSO 200 μ l,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A490）。選擇抑制率約為10%的藥物濃度為亞細(xì)胞毒劑量濃度。腫瘤細(xì)胞抑制率=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值）/對(duì)照組A值×100%

1.4 MTT法檢測(cè)紫杉醇對(duì)放療的增敏作用將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞隨機(jī)分為四組:細(xì)胞對(duì)照組(不進(jìn)行藥物處理,給予等體積PBS）;單純照射組(細(xì)胞以6 Gy劑量進(jìn)行照射）;單純紫杉醇用藥組(細(xì)胞加入亞細(xì)胞毒劑量紫杉醇）;照射聯(lián)合紫杉醇組(細(xì)胞加入亞細(xì)胞毒劑量紫杉醇后,以6 Gry劑量進(jìn)行照射）。將培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞以5×103/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板,按上所述對(duì)各組細(xì)胞分別進(jìn)行處理,24 h后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞增殖抑制情況;同時(shí)MTT法檢測(cè)各孔在490 nm處的光吸收值(A490）,按公式計(jì)算各組抑瘤率。

1.5 流式細(xì)胞分析同上將腫瘤細(xì)胞以5×103/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板,按分組分別進(jìn)行相應(yīng)處理,24 h后胰酶消化,各組收集細(xì)胞2×106個(gè)。70%冰乙醇固定,PI染色后流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)紫杉醇對(duì)放療的增敏作用結(jié)果顯示隨著紫杉醇濃度的增加,細(xì)胞存活率降低,呈現(xiàn)明顯劑量依賴(lài)性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中選擇濃度10-8 μ mol/ml為亞細(xì)胞毒劑量進(jìn)行給藥。

如前述對(duì)細(xì)胞分別進(jìn)行單純照射、單純紫杉醇用藥、照射聯(lián)合紫杉醇用藥處理,結(jié)果可見(jiàn),與對(duì)照組相比,亞細(xì)胞毒劑量紫杉醇用藥組細(xì)胞體外增殖活性抑制不明顯,單純照射組及照射聯(lián)合紫杉醇組細(xì)胞抑制率均高于空白對(duì)照組,且照射聯(lián)合紫杉醇組高于單獨(dú)照射組。MTT檢測(cè),細(xì)胞抑制率分別為10.8%,30.4%和45.5%。鼻咽癌對(duì)放療敏感,而紫杉醇可進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)射線的敏感度。

2.2 不同處理對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞處理24 h后,進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè),結(jié)果顯示單純照射組、單純紫杉醇用藥組、照射聯(lián)合紫杉醇組均出現(xiàn)不同程度凋亡,其中單純照射組高于單純紫杉醇用藥組,照射聯(lián)合紫杉醇組顯著高于單純照射組和單純用藥組。單純照射6 Gy引起的阻滯以G2/M期為主;紫杉醇聯(lián)合照射可進(jìn)一步誘導(dǎo)G2/M期阻滯。

3 討論

放射治療為鼻咽癌的主要治療手段,早期病人單純放療效果較好,但因其發(fā)生部位隱蔽,癥狀多樣性,就診病人70%為Ⅲ期、Ⅳa期的局部晚期病人,單純放療療效較差,局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為常見(jiàn)的失敗原因。為提高局部晚期鼻咽癌的治療效果,局部放療和全身化療相結(jié)合成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示以DDP和5-Fu為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)化療提高了局部晚期頭頸部癌放療的效果,同時(shí)放化療具有兩種細(xì)胞毒作用同時(shí)疊加,縮短總療程時(shí)間的優(yōu)勢(shì),一些化療藥物還有放射增敏作用,試驗(yàn)結(jié)果顯示其療效優(yōu)于序貫化放療[1]。

紫杉醇(Tatol,paclitaxel）是近年來(lái)研究開(kāi)發(fā)的化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、作用機(jī)制獨(dú)特的新型抗腫瘤藥物[2]。它可促進(jìn)微管雙聚體裝配成微管,并阻止微管蛋白解聚,使微管穩(wěn)定,從而阻礙細(xì)胞分裂,使其發(fā)生凋亡,達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。該物在卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌治療中顯示了良好的療效;在頭頸部腫瘤中也具有很好的單藥有效性[3,4]。近期研究表明紫杉醇對(duì)包括頭頸部癌在內(nèi)的一系列細(xì)胞系具有明顯的放射增敏作用[5]。其獨(dú)特的放射增敏機(jī)制表現(xiàn)為G2/M期細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞再氧合[6,7],而處于G2/M期細(xì)胞周期的腫瘤細(xì)胞對(duì)放療敏感。

本研究結(jié)果顯示照射聯(lián)合紫杉醇組腫瘤抑制率顯著提高,流式細(xì)胞檢測(cè)紫杉醇則可將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,與文獻(xiàn)報(bào)道相符。紫杉醇與放療協(xié)同作用后,顯著阻滯了細(xì)胞的總細(xì)胞周期進(jìn)展,從而明顯增強(qiáng)了抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的作用,大大提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明紫杉醇與放療聯(lián)用,可顯著提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性,而其對(duì)細(xì)胞周期的影響可能是提高細(xì)胞放射敏感性的機(jī)制之一。

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