王心童,王虹蛟,王 強(qiáng),孟威宏,顏煒群

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院,吉林 長春 130021;2.長春解放軍第461醫(yī)院,吉林 長春 130021;3.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院;4.吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所）

關(guān)于肝纖維化機(jī)制及防治研究,目前是國內(nèi)外生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[1-6]。本論文利用實(shí)驗(yàn)鼠的四氯化碳(CCl4）慢性肝損傷模型,同時(shí)利用膠原纖維染色檢測方法觀察抑肽酶對實(shí)驗(yàn)性慢性肝損傷大鼠肝組織纖維化改變的影響,并對其作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wister大鼠,雌雄兼用,由長春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物研究中心提供,合格證號:醫(yī)動(dòng)字第1055118。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠慢性CCl4肝損傷模型的建立 Wister大鼠,體重190-210 g,雌雄各半,由高新實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用新鮮的花生油作為溶劑。將25%CCl4溶解于花生油中混勻。正常對照組僅皮下注射花生油5 ml/kg,其它各組大鼠首次給予CCl4原液5 ml/kg,以后每周2次25%CCl4液(花生油稀釋）5 ml/kg皮下注射。禁食,不禁水。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 (1）第1組為正常對照組:腹腔注射等量生理鹽水。(2）第2組為慢性肝傷損模型組:腹腔注射等量生理鹽水。(3）第3組為抑肽酶小劑量組:腹腔注射抑肽酶2萬KIU/kg。(4）第4組為抑肽酶中劑量組:腹腔注射抑肽酶4萬KIU/kg。(5）第5組為抑肽酶大劑量組:腹腔注射抑肽酶8萬KIU/kg。(6）第6組為促肝細(xì)胞生長素注射液組(陽性組）:腹腔注射促肝細(xì)胞生長素100 mg/kg。3-5組每天給予抑肽酶一次,連用4周,第6組每天給予促肝細(xì)胞生長素一次,連用4周。禁食,不禁水。

1.2.3 膠原纖維染色 末次給藥1小時(shí)后處死大鼠,取肝大葉相同部位的一小塊肝組織固定于10%福爾馬林,常規(guī)法制做組織切片,利用Masson氏染色法染色進(jìn)行膠原纖維染色后,在光鏡下觀察肝細(xì)胞變性壞死程度、肝間質(zhì)纖維增生程度。利用Olympus圖像分析軟件自動(dòng)分析藍(lán)染膠原面積。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,各組之間數(shù)據(jù)比較均采用兩組資料秩和檢驗(yàn)的方法。

2 結(jié)果

利用Masson氏染色法染色肝組織膠原纖維以評測肝組織纖維化程度。膠原纖維被染為藍(lán)色或綠色,其它細(xì)胞、組織以紅色著色為主。利用Olympus圖像分析軟件自動(dòng)分析藍(lán)染膠原面積?？瞻讓φ战M極少見著色的膠原纖維,僅在血管周圍可見少量藍(lán)染膠原纖維區(qū)域,相對膠原面積為(0.9±0.01）%。模型對照組膠原纖維增生明顯,穿插肝組織形成較為明顯的假小葉,膠原纖維總面積大,相對膠原面積為(27±3.12）%。抑肽酶小劑量組膠原纖維增生明顯,相對膠原面積為(25±3.81）%,同模型組相比無明顯減輕趨勢。抑肽酶中劑量組,膠原纖維增生以局部多見,較少相互交叉形成假小葉,相對膠原面積為(19±5.18）%,與模型組相比膠原面積顯著減少(P＜0.05）。抑肽酶大劑量組,膠原纖維增生較輕,匯管區(qū)及血管周圍可見輕度膠原纖維增生,無假小葉形成,相對膠原面積為(6±1.93）%,與模型組相比顯著降低(P＜0.05）。促肝細(xì)胞生長素組膠原纖維增生明顯,以匯管區(qū)居多,假小葉形成較少,相對膠原面積分別為(24±9.8）%。與模型組相比顯著降低(P＜0.05）。并且隨著抑肽酶劑量的增加,膠原纖維增生減輕。尤其以抑肽酶大劑量組效果最為明顯,優(yōu)于促肝細(xì)胞生長素組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抑肽酶能夠顯著抑制大鼠肝臟纖維化。

3 討論

肝纖維化的形成是一緩慢而復(fù)雜的過程,不論何種致病因素,其機(jī)制都是肝臟受到外界刺激后引起細(xì)胞因子的釋放,細(xì)胞因子-細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用,使肝臟細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂,在狄氏間隙過沉積,繼之肝竇毛細(xì)血管化是形成肝纖維化的分子病理學(xué)基礎(chǔ)。最終使基質(zhì)沉積于肝臟。TGF-β在肝纖維化中的作用:TGF-β是一組具有多種功能的蛋白多肽。在肝纖維化時(shí)它能刺激細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、ⅩⅧ型等大多數(shù)膠原mRNA水平的提高或蛋白產(chǎn)物的增加,并有調(diào)節(jié)肝臟再生的能力。腫瘤壞死因子α(TNF-α）:在體外TNF-α可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞及星狀細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化。白細(xì)胞介素族(IL-1、6）:IL-1主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,它能刺激成纖維細(xì)胞和HSC產(chǎn)生膠原。IL-6有較強(qiáng)的促進(jìn)HSC增殖的作用,使細(xì)胞外基質(zhì)的合成總量增加,IL-6還能促進(jìn)α-2巨球蛋白的表達(dá),抑制膠原酶活性,導(dǎo)致肝內(nèi)膠原沉積。活化的枯否細(xì)胞可產(chǎn)生氧自由基從而損傷肝細(xì)胞,肝細(xì)胞損傷可引起肝星狀細(xì)胞活化。肝細(xì)胞能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,如成纖維細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)化生長因子α、白介素-1、6、8及單核巨噬細(xì)胞集落刺激因子等。肝細(xì)胞通過將無生物活性的物質(zhì)代謝為致纖維化物質(zhì)而發(fā)揮作用。

CCl4致慢性肝損傷的主要機(jī)制是CCl4在肝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生三氯甲基自由基,引起脂質(zhì)過氧化以及直接的膜溶解作用,使肝細(xì)胞壞死。CCl4可經(jīng)肝內(nèi)微粒體酶活化生成自由基,通過脂質(zhì)過氧化物作用損傷破壞肝細(xì)胞,致使血清ALT、AST水平顯著增高。肝功能受損后,肝細(xì)胞制造白蛋白(A）的能力降低,引起A/G比例下降。CCl4慢性肝損組大鼠,正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,有廣泛的脂肪變性、肝細(xì)胞壞死及不同程度的間質(zhì)纖維增生。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯φ战M膠原纖維增生明顯,穿插肝組織形成較為明顯的假小葉,膠原纖維總面積大。促肝細(xì)胞生長素組膠原纖維增生明顯,以匯管區(qū)居多,假小葉形成較少。抑肽酶小劑量組膠原纖維增生明顯,同模型組相比無明顯減輕趨勢。抑肽酶中劑量組,膠原纖維增生以局部多見,較少相互交叉形成假小葉,與模型組相比膠原面積顯著減少。抑肽酶大劑量組,膠原纖維增生較輕,匯管區(qū)及血管周圍可見輕度膠原纖維增生,無假小葉形成。并且隨著抑肽酶劑量的增加,膠原纖維增生減輕。尤其以抑肽酶大劑量組效果最為明顯,優(yōu)于促肝細(xì)胞生長素組。

抑肽酶是一種是廣譜的非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑,被廣泛用于體外循環(huán)的心血管手術(shù)和多種疾病的治療[7-15]。目前國內(nèi)外對抑肽酶保護(hù)肝損害的研究主要集中在:實(shí)驗(yàn)性大鼠肝缺血再灌注損傷、人的肝癌切除術(shù)和原位肝移植的保護(hù)作用機(jī)制的研究。但目前國內(nèi)外尚未見到有關(guān)抑肽酶對實(shí)驗(yàn)性慢性肝損傷大鼠肝組織纖維化改變方面的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過利用膠原纖維染色檢測方法觀察,顯示抑肽酶對大鼠慢性CCl4肝損傷模型具有很好的保護(hù)性作用,明顯減輕慢性肝損傷的程度,抑制肝纖維化的發(fā)展。盡管其作用機(jī)制還不清楚,但從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以認(rèn)為是從減輕肝細(xì)胞的損傷及抑制肝纖維化的發(fā)展兩個(gè)方面對慢性肝損傷起到保護(hù)性作用的。

[1]Kaplowitz N.Mechanisms of liver cell injury[J].J Hepatol,2000,32(1 Suppl）:39.

[2]Patel T,Gores GJ.Apoptosis and hepatobiliary disease[J].Hepatology,1995,21(6）:1725.

[3]Scaffidi C,Fulda S,SrinivasanA,et al.Two CD95(APO-1/Fas）signaling pathways[J].EMBO J.1998,17(6）:1675.

[4]王虹蛟,張馨木,常淑芳,等.抑肽酶對小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué).2005,9(3）:420.

[5]孟威宏,王虹蛟,張馨木,等.口服抑肽酶對大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版,2006,32(3）:370.

[6]王虹蛟,孟威宏,王強(qiáng),等.抑肽酶對實(shí)驗(yàn)性慢性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2008,12(1）:4.