李 蕾,楊 嵐,陳國千*

(1.南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科,江蘇無錫214023;2.南京醫(yī)科大學附屬無錫婦幼保健院檢驗科)

高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)為細胞核中一種典型的非組蛋白,于20世紀70年代在胸腺中與染色體DNA一起純化而被發(fā)現,因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移性而得名。HMGB1曾稱為HMG-1、amphoterin,早期集中研究其核內功能,包括參與核小體的構建和穩(wěn)定、調節(jié)基因的轉錄、參與DNA的重組修復和復制等。1999年,Wang等[1]發(fā)現HMGB1可以釋放到胞外并介導炎癥反應,為一種重要的晚期炎癥介質,隨后胞外HMGB1的致炎作用引起國內外廣泛重視,諸多研究表明胞外HMGB1在急慢性炎癥性疾病如膿毒癥、關節(jié)炎、肺炎、急性胰腺炎等的發(fā)病過程中起著重要作用。現就HMGB1的檢測方法和臨床應用進展作一綜述。

1 胞外HMGB1的致炎作用

HMGB1廣泛分布于淋巴組織、腦、肝、肺、心、脾、腎等組織細胞中,主要存在于胞核,分子量約30 kDa。研究[2,3]顯示巨噬細胞、單核細胞、垂體細胞、上皮細胞、肝細胞等受內毒素脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、干擾素γ(IFN-γ)、生物活性脂等誘導后,HMGB1可主動分泌到細胞外。HMGB1因缺乏引導肽結構而不能以高爾基體/內質網途徑分泌,可能通過非經典途徑(如分泌溶酶體)釋放。HMGB1胞外釋放涉及胞核內HMGB1轉移到胞漿然后胞外的過程[4]。壞死或受損細胞也可被動釋放HMGB1,但凋亡細胞由于HMGB1緊密結合于染色質而不能釋放HMGB1。胞外HMGB1與相應胞膜受體如晚期糖基化終末產物受體(RAGE)、Toll樣受體2(TLR2)、Toll樣受體 4(TLR4)等結合,通過胞內信號轉導而發(fā)揮其生物學效應[2]。

近年諸多研究[2]證實,胞外HMGB1為一種重要的炎癥介質和致炎細胞因子。體外實驗表明,重組HMGB1激活巨噬細胞、外周血單核細胞、內皮細胞、肝細胞等表達和釋放TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、巨噬細胞炎癥蛋白 -1α(MIP-1α)、MIP-1β、細胞間粘附分子-1(ICAM-1)、血管細胞粘附分子(VCAM-1)等炎癥介質或致炎細胞因子,啟動和維持炎癥免疫反應或使炎癥惡化。最近Qin等[5]報道 HMGB1通過MAPK p38磷酸化明顯加強內毒素的致炎作用。體內實驗也顯示HMGB1的致炎作用,給予小鼠半數致死量(LD 50)內毒素后8小時,血清HMGB1濃度升高,16-32小時后血清HMGB1水平達高峰,注射抗HMGB1抗體能有效抑制內毒素血癥或膿毒癥小鼠的炎癥反應并降低死亡率[1];小鼠氣管內給予HMGB1可誘發(fā)急性肺損傷,病變部位發(fā)生中性粒細胞聚集、水腫以及有早期致炎細胞因子如 IL-1β、TNF、MIP-2的產生,且呈劑量依賴效應[2];腦室內注射HMGB1后增加腦組織TNF、IL-6的表達,引發(fā)中樞神經系統(tǒng)的炎癥反應;小鼠關節(jié)內注射HMGB1后可誘發(fā)關節(jié)炎。

2 HMGB1檢測方法

目前,胞外HMGB1檢測有蛋白免疫印跡(Western Blot)[1]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)[6,7]和凝膠阻滯分析(EMSA)[8]三種方法。蛋白免疫印跡分析是將蛋白質轉移到膜上,然后利用抗體進行檢測,操作繁瑣費時,靈敏度低,準確性差,屬于定性或半定量檢測。

近年,Yamada等[6]使用抗HMGB1單克隆抗體建立了雙抗體夾心ELISA法檢測HMGB1,靈敏度、準確性、特異性明顯提高,與HMGB2無交叉反應,且操作方便,可成批檢測。Yamada等[6]建立的ELISA方法以辣根過氧化物酶為標記酶,而底物有四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、PS-1和PS-atto,前者為比色分析,后二者為發(fā)光分析;以PS-1為底物的 ELISA方法,有效檢測范圍為2-100 ng/ml,批間、批內變異系數分別為＜10%和＜5%,回收率為92-111%;而以四甲基聯(lián)苯胺、PS-atto為底物的ELISA方法,靈敏度提高,檢測線性范圍分別為1-100 ng/ml和0.3-160 ng/ml。Urbonaviciute等[7]建立以生物素-親和素系統(tǒng)為標記物和對硝基苯磷酸酯為底物的夾心ELISA法,檢測線性范圍達0.4-300 ng/ml,但Urbonaviciute等認為血清或血漿中存在抗HMGB1抗體和其它HMGB1結合蛋白,影響HMGB1的準確定量,應引起重視。為了進一步縮短檢測時間,國內王維等使用抗HMGB1單克隆抗體以辣根過氧化物酶為標記酶(底物:鄰苯二胺)建立了直接競爭ELISA法,測定范圍為1-320 ng/ml,回收率為 97%-106%,變異系數為2.6%-7.3%。目前市場已有HMGB1的商品化ELISA試劑盒供應,日本Shino-Test公司供應的以四甲基聯(lián)苯胺為底物的ELISA試劑盒,其批間、批內變異系數分別為＜8%和＜5%,血清或血漿標本回收率為80-120%,HMGB1最低檢測濃度為＜1 ng/ml。

最近,Gaillard等[8]利用HMGB1蛋白與DNA片段探針呈高親和力結合的特性,以同位素作探針標記,在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳,與HMGB1結合的DNA探針在凝膠中泳動速度慢,表現為相對滯后,以此原理建立凝膠阻滯分析(EMSA)。此方法對于成分復雜的標本如血清檢測靈敏度達1 ng/ml,而對于成分不復雜的標本如細胞培養(yǎng)上清液則靈敏度更高,且不易受血清中的干擾蛋白影響。

由于HMGB1在血液、體液、細胞培養(yǎng)液、灌洗液等標本中一般含量較低,采用上述方法有時難以檢出或準確定量,因此HMGB1測定方法有待進一步改進,以提高檢測的靈敏度和準確性。另外,因細胞溶解可釋放HMGB1,HMGB1檢測的血液標本應立即分離血清或血漿。

3 HMGB1檢測的臨床應用

鑒于HMGB1在諸多疾病發(fā)病過程中的重要作用和HMGB1測定方法的改進,臨床標本尤其血清中HMGB1檢測的意義和應用日益受到重視。

諸多研究[1,9]顯示膿毒癥患者血清HMGB1水平明顯升高,并發(fā)現血清HMGB1水平與血清C-反應蛋白、降鈣素原、脂多糖結合蛋白、白細胞介素-6水平及白細胞計數等炎癥指標間具有一定的相關性,但血清HMGB1水平與膿毒癥嚴重程度及其預后的關系觀點尚未一致。Zoelen等[10]報道腹膜炎所致膿毒癥患者的腹水HMGB1水平為血漿HMGB1水平的10倍以上,肺炎所致膿毒癥患者的支氣管肺泡灌洗液HMGB1水平明顯高于正常對照組,提示HMGB1釋放可能主要發(fā)生在感染部位。

活動期類風濕關節(jié)炎患者血漿HMGB1水平顯著高于健康對照組,并與紅細胞沉降率、C-反應蛋白水平呈正相關,但風濕性關節(jié)炎患者血清或血漿中HMGB1水平未見升高[11]。

重癥急性胰腺炎患者血清HMGB1水平明顯升高,血清HMGB1水平與該病嚴重程度有關,并與乳酸脫氫酶、C-反應蛋白及總膽紅素指標等呈顯著性正相關。Lindstrom等[12]報道重癥急性胰腺炎患者血清HMGB1水平與患者是否發(fā)展出現器官衰竭無關聯(lián)。

社區(qū)獲得性肺炎患者血清HMGB1水平升高,但與并發(fā)膿毒癥無關。并發(fā)流感病毒感染的嚴重細菌性肺炎患者血漿HMGB1水平明顯高于單純細菌性肺炎患者,且前者血漿HMGB1水平與白細胞計數呈較好的相關性[13]。

慢性乙型肝炎患者血清HMGB1水平與病情的嚴重程度密切相關,HMGB1可能在慢性重型乙型肝炎患者肝衰竭的發(fā)生中起重要作用。HIV-1感染者血漿HMGB1水平明顯升高,血漿HMGB1水平與性別、年齡、病毒量、CD4或 CD8 T-細胞數等無顯著相關性[14]。

變應性肉芽腫性血管炎(亦稱Churg-Strauss綜合征)患者血清HMGB1水平明顯高于哮喘患者和健康者,與血清可溶性IL-2受體、可溶性血栓調節(jié)素、嗜酸性細胞陽離子蛋白等水平呈顯著性正相關,患者經激素治療后血清HMGB1水平下降[15]。Yamada等[6]結果顯示,隨后發(fā)生心搏停止或急性心肌梗塞致死的急性冠脈綜合癥患者血清HMGB1水平明顯高于未發(fā)生心臟意外者,如果以血清HMGB1水平0.6 ng/mL為界值,血清HMGB1水平用于預測急性冠脈綜合癥患者一個月內發(fā)生心臟意外的特異性和靈敏度分別為87%和71%。穩(wěn)定型心絞痛和不穩(wěn)定型心絞痛患者血清HMGB1水平與冠狀動脈狹窄嚴重程度有關[16]。

血清HMGB1水平與組織缺血有關,失血性休克患者在休克后24小時內血清HMGB1水平升高,72小時達到峰值,96小時開始下降,而患者血壓恢復和臨床癥狀改善后,血清HMGB1水平也恢復正常。急性冠脈綜合征和大腦缺血患者血清HMGB1水平明顯升高[17]。彌散性血管內凝血使血漿HMGB1水平顯著升高。缺血致血清HMGB1水平升高的機理還不清楚,可能是缺血后的TNF反應性升高激活免疫細胞釋放HMGB1,或由損傷細胞或死亡細胞釋放HMGB1。

機械外傷致血清HMGB1水平顯著升高,外傷后1小時血清HMGB1水平升高30倍,2-6小時達峰值,并維持高值至136小時以上[18];外科術后患者血清HMGB1水平升高,并與術后并發(fā)癥有關,術后血清HMGB1水平測定有助于術后并發(fā)癥的監(jiān)測[19];燒傷后患者血漿HMGB1水平明顯升高。

腦膜炎患者腦脊液HMGB1水平升高,而細菌性腦膜炎患者腦脊液HMGB1水平為非細菌性腦膜炎患者的4倍,并與白細胞計數呈較好的正相關;蛛網膜下腔出血患者腦脊液HMGB1水平也明顯升高,并與腦脊液中IL-6、IL-8及TNF-α水平呈顯著性正相關[20]。風濕性關節(jié)炎患者關節(jié)滑液HMGB1水平升高,并明顯高于骨關節(jié)炎患者。我們最近研究顯示,胸水HMGB1水平檢測對于胸腔漏出液與滲出液以及滲出液性質的鑒別診斷具有較好的臨床意義,若結合胸水HMGB1/血清HMGB1比值分析,能進一步提高該指標的應用價值(待發(fā)表)。

胞外HMGB1作為一種重要的炎癥介質已引起廣泛重視,隨著HMGB1定量檢測方法如ELISA的建立,使之HMGB1檢測的臨床應用具有可行性。近年國內外很重視胞外HMGB1的臨床研究,以了解胞外HMGB1在臨床疾病發(fā)病機理中的作用,探討胞外HMGB1測定在疾病風險預測、臨床疾病診斷、預后判斷中的意義,以及開辟臨床疾病的HMGB1靶向治療新途徑。

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